7.浅谈石蜡包埋组织个体识别与医疗纠纷

刘艳芳¹，孙漪¹，刘金山²，扎拉嘎白乙拉¹

（1.中南大学基础医学院法医学系，湖南长沙410013，2.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古通辽，028000）

医疗纠纷是指发生在医疗卫生、医学美容、预防保健等具有合法资质的医疗企事业法人或机构中一方或多方当事人认为另一方或多方当事人在提供医疗服务或履行法定义务时存在过失，造成实际损害后果，应承担违约责任或侵权责任，但双方或多方当事人对所争议事实认识不同、相互争执、各执己见的行为。随着社会法律制度的不断健全，人们自我维权意识的日渐增强，就医者对医疗结果的期望值与我国医疗现状形成的反差也就越大，发生医疗纠纷案件呈现出逐年上升的趋势，对医务工作者殴打、砍杀事件全国各省都有发生，不仅扰乱了正常的医疗秩序，也对医务工作者造成了极大的精神压力，因此，防范和减少医疗纠纷，更好的保护医疗纠纷中的受害人，维护医院的正常秩序，对社会的稳定具有极大的现实意义。

近年来，病理误诊引发的医疗纠纷有日益增加的趋势，其鉴定成为社会关注的焦点，而该类纠纷往往会涉及一些特殊的检材，如石蜡包埋组织，组织经过石蜡包埋后会发生DNA降解，从而导致病理组织的同一认证成为目前法医学鉴定难点之一^［1］。石蜡包埋组织个体识别鉴定是解决或预防此类纠纷的关键，因此在医疗纠纷中如何出具更可行、更有说服力的石蜡包埋组织鉴定结果会对个体识别提出更高的要求。本文主要从我国医疗纠纷和石蜡包埋组织引发医疗纠纷的原因、石蜡包埋组织个体识别以及预防个体识别引发纠纷的角度进行讨论，从而使鉴定结果更有严谨性、权威性，以减少和防范病理相关医疗纠纷的发生。

1　医疗纠纷和石蜡包埋组织引发纠纷发生的原因

1.1　医疗纠纷发生的原因

在医患关系的互动中，医疗纠纷的发生是不可避免的，近年来，我国已成为世界上医疗纠纷发生率最多的国家之一^［2］。目前我国医疗纠纷发生的原因主要有外部因素和内部因素^［3］。外部因素包括患者对医疗的期望值过高、对医疗行业的高风险性和特殊性缺乏了解、新闻媒体的过多炒作宣传、更有患者为索取赔偿或逃避医疗费用的无理取闹、医疗卫生体制不健全等。内部因素包括医院管理秩序混乱、医务人员之间协调力度不够、医生法律意识薄弱，自我保护意识缺乏、服务态度差或与患者沟通不到位、缺乏责任心或违反临床医疗规范、医疗病历书写或其他意外伤害等。面对医疗纠纷的发生，梳理医疗纠纷发生发展，寻找科学的物证检材证据成为有效化解和处理医疗纠纷的首要任务。

1.2　石蜡包埋组织引发纠纷发生的原因及后果

病理学诊断被称为临床诊断的“金标准”，是疾病的诊断，治疗以及预防判断的决定性依据，石蜡包埋组织引发的纠纷属于病理医疗纠纷范畴，一般认为该类医疗纠纷的原因主要是：①病理误诊，诊断过头——假阳性，诊断过低——假阴性；②病理漏诊；③其他明显过失，如样本标本丢失或标本编号张冠李戴等^［4］。导致漏诊、误诊的原因包括病理学诊断的自身局限性（如对疾病的认知不足或病理检查技术的有限性）和医源性过失，医源性过失包括病理学检查缺乏管理规范、临床医生与病理医生之间缺乏沟通、临床医生不重视外院诊断报告、病理技术人员责任心问题以及病理报告不严谨等^［5］。而石蜡包埋组织引发的医疗纠纷主要是需要进行个体识别标本编号张冠李戴引发的，导致严重的后果如：耽误患者及时接受正确治疗或治疗不当甚至导致患者死亡；错误地切除患者的组织器官侵犯了患者的身体的完整性；使患者遭受精神上和肉体上的痛苦；还会导致不必要的医疗费用开销甚至会造成严重的法律后果，构成犯罪等^［6］，均会引起医疗纠纷或诉讼。

2　石蜡包埋组织的个体识别

2.1　涉及医疗纠纷的石蜡包埋组织

石蜡包埋组织是病理学、法医病理学进行科学研究和疾病诊断长期保存的常用检材，亦是涉嫌保险欺诈、医疗纠纷等刑事、民事案件的法医物证检材，目前最常用的是10%的甲醛固定石蜡包埋组织。在世界各地医院病理科以及病理研究所中都保存的大量石蜡包埋组织，这是一个致病相关基础研究的可靠的材料来源，在诊断与鉴别诊断研究和患者疾病预后评估等方面均具有重要价值。在病理相关医疗纠纷中，石蜡包埋组织个体识别鉴定已成为解决此类纠纷的重要证据，然而在病理学科室，福尔马林固定的石蜡包埋组织是需要一定时间保存的，甲醛作为固定组织的一个重要组成部分，可以引起核酸大分子之间、核酸与蛋白质之间的广泛交联，长时间的固定也会导致DNA降解情况的发生；另外石蜡固定组织DNA的质量还与固定前组织的类型、大小，固定的pH、温度，保存温度、提取方法等有关^［1］。因此，发生病理相关医疗纠纷时，要从石蜡包埋组织中提取高质量的DNA进行个体识别是一件十分必要但又十分困难的事情。一旦出现检材与患者不符的情况，便会进一步激化医疗纠纷，引出新的纠纷点。

2.2　石蜡包埋组织的鉴定

在石蜡包埋组织的鉴定中，患方要求鉴定医院所提供的病理组织是否来源于自身，这样，石蜡包埋组织的个体识别能够为解决该类医疗纠纷提供充分的证据支持。

短串联重复序列（STR）具有高度多态性，对模板要求低，容易扩增等优点^［7］，是目前法医DNA分析中最常用的遗传标记^［8］。在对石蜡包埋组织提取时，福尔马林固定时间、石蜡切片厚度、不同的脱蜡方法等均可以影响石蜡包埋组织提取的DNA质量，从而影响基因分型；另外不同石蜡组织的DNA降解程度也会有所不同，即使通过优化蛋白酶消化条件、精简DNA提取的步骤以及纯化DNA模板可以提高DNA质量，STR技术也不能成功地得到所有分型结果，经常会出现只获得部分分型结果或丢失等位基因的情况^［9］；通过增加PCR循环次数或采用PCR巢式扩增可以提高扩增产物量和扩增特异性，但并不能明显改善其检出率^［10］。因此，如何克服石蜡检材中DNA降解严重对DNA分型的影响以及如何提高石蜡包埋组织基因分型成功率成为石蜡包埋组织STR鉴定的难点。

miniSTR分型技术被证明能够在低拷贝或降解检材中有效获取遗传信息，能明显提高降解检材的分型成功率^{［11，12］}。miniSTR分型技术与常规STR分型技术相比，核心序列的重复次数并没有改变，只是在设计引物时，使引物结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列上，PCR扩增产物就会比STR基因座更短一些，因此产生的STR等位基因片段长度更短，分型成功率获得很大提高^［13］。有研究表明，用常规STR分型无法获取对福尔马林固定石蜡包埋组织的完整分型时，可应用MiniFiler ^TM试剂盒进行检测分型，从而尽可能得到完整的分型结果。但由于引物太接近重复序列，在miniSTR引物和STR引物的结合位置之间的STR位点侧翼序列上，若发生碱基插入或者缺失，就会得到不同的等位基因分型结果。所以使用扩增片段较小的MiniSTR商品化检测试剂盒进行分型检测时，依然存在等位基因缺失或位点丢失、Pull－up峰、不平衡峰等问题，影响MiniSTR在实际案件中的应用^［10］。另外，理论上认为目标DNA片段越小，就越能有效的获取遗传信息；但实际上，在使用miniSTR分型技术检测小于150bp的扩增产物时，易受到荧光标记引物“污斑”的影响而使检测峰更宽，信号更弱^［9］。所以在当石蜡包埋组织出现严重降解情况时，STR遗传标记的缺陷就会影响个体识别分析结果的完整性和正确性。

SNP（单核苷酸多态性）是指个体间基因组水平上，特定核苷酸变异（替代、插入或缺失）所引起的多态性，其基因在群体中的分布频率不低于1%；作为第三代遗传学标记，SNP具有数量丰富、突变率低、适合降解检材和混合样本检测等优点^［14］。当DNA出现严重降解情况时，通过可靠的复合扩增程序，许多SNPs可通过45～55bp大小的识别序列（即两个侧翼PCR引物的长度）进行识别^［15］，与STR扩增产物的300～400bp相比，更适用于DNA的降解样本，具有较高的检测成功率；且SNP每个等位基因上不出现stutter带，有助于简化等位基因分析^［10］，从严重降解的石蜡包埋组织DNA中获得更多的遗传信息，所以能够为石蜡组织包埋基因分型提供新的思路。SNP分为二等位基因单核苷酸多态性（binary SNP）和非二等位基因单核苷酸多态性（nonbinary SNP）。有研究表明，需要50～60个二等位基因SNP才可以达到与12个常规STR遗传标记大致相同的分型效能^［16］，所以在进行石蜡包埋组织严重降解样本或个体识别时，不仅会增加鉴定成本，而且会大大增加了数据分析的难度，对法医学家来说是一个巨大的挑战。Nonbinary SNP是指在基因组的特定核苷酸位置出现了两个以上碱基，其中最少的一种碱基在群体中的频率大于1%，其遗传信息量优于二等位基因SNP，检测数量更少的Nonbinary SNP就可以达到现有STR分型系统同样的检测效能^［17］。2004年，Phillips等人首次提出了Nonbinary SNP在法医个体识别中应用的可能性^［17］。2012年扎拉嘎白乙拉等在中国人群中发现了20个Nonbinary SNP，并建立了荧光复合检测体系用于法医个人识别^［18］，随着该类试剂盒的推广和普及，会在司法鉴定个体识别上发挥更重要的作用。

上述的鉴定技术都有各自的特点，目前应用较普遍的是STR分型技术，但追求速度更快、结果更精确、价格更低廉，应用更方便的鉴定技术始终是法医DNA检测技术的目标，因此随着鉴定技术的不断改善，miniSTR技术、SNPs分型技术等的应用一定会为石蜡包埋组织个人识别检材做出更大的贡献，也会为解决医疗纠纷提供越来越多的帮助。

3　预防个体识别引发医疗纠纷

由于医疗行为具有高风险性，复杂多变性等特点，以及我国医疗现状各种内外因素的结合，医疗纠纷的发生是不可避免的。为预防与个体识别有关的医疗纠纷，患者标本的提取和保存是进行个体识别，解决纠纷的关键。因此要加强检材组织的保存意识，取材过程中避免取材不当、样本丢失或标本标号错误等情况的发生；一旦出现切片丢失情况，要与患者及时沟通说明，并签写说明，分清责任，承担后果，协商解决方法。进行个体识别的检材在采集过程中必须避免交叉污染和混淆，提取时要谨慎小心。另外也需有专门的患者标本管理人员和管理室；管理人员要定期参加管理培训，使其对病理检材保管问题有正确充分的认识和防范意识；管理室要宽敞明亮，通风设备齐全。所有保存的检材必须明确标记便于区分，保存过程中通过个体识别、同一认证进行定期抽查，防止意外发生，最大限度预防和缓解医疗纠纷。

总之，在处理病理相关医疗纠纷个体识别过程中，必须保存好相关病理组织标本，严格控制取材程序，减少医疗纠纷的发生，更好地服务于我国医疗纠纷的解决，维护医疗机构，保护患者的合法权益。

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