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第四节 附睾及男性附属性腺功能指标测定
一、 附睾功能指标
附睾是精子运送、成熟、贮存的场所，并对精子起保护作用，附睾功能紊乱直接影响男性的生育力。左旋肉毒碱和中性α-葡糖苷酶是临床常使用的附睾标志物。中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱的特异性、敏感性更高。
（一） 精浆中性α-葡糖苷酶测定 1. 原理
麦芽糖两个吡喃葡萄糖残基，由α-1，4-糖苷键相连，经α-葡糖苷酶作用，水解糖苷键生成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶法测定其生成量。
2. 试剂
①醋酸盐缓冲液；②麦芽糖基质液；③葡萄糖标准液；④Tris -HCl缓冲液；⑤9.0g/L NaCl溶液；⑥葡萄糖氧化酶试剂。
3. 操作步骤
（1） 临用前配制葡萄糖氧化酶试剂。
（2） 将液化的精液离心沉淀后，取精浆，按下表操作测定。
混匀，37℃水浴15分钟后用505nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度
（3） 计算：
α-糖苷酶浓度（U/ml）=测定管吸光度/标准管吸光度×20
单位定义：每毫升精浆与底物在37℃作用30分钟，产生0.1mg葡萄糖为1单位。
（4） 参考值：35.1～87.8U/ml。
（5） 注意事项：
精液在操作中应注意以下几个问题：
1） 取液化好的精液标本，3000rpm离心10分钟，取上清精浆1～2ml，放置于-20℃保存备用；
2） 离心好的精浆保存所用器皿必须经硫酸或盐酸浸泡过夜，然后洗净备用。若用一次性聚乙烯试管效果更佳；
3） 尽快分离精浆，及时测定。
（二） 精浆肉毒碱测定 1. 原理
肉毒碱与乙酰辅酶A通过肉毒碱酰基转移酶作用，催化生成乙酰肉毒碱和辅酶A，辅酶A和埃尔曼试剂DTNB，发生反应生成黄色的终产物，其吸收光谱为412nm。
2. 试剂
①0.1mol/L，pH 7.5，Tris-HCl缓冲液；②氯仿-异丁醇混合液，按氯仿：异丁醇=2∶1配制；③DTNB溶液：用Tris-HCl缓冲液进行配制，使成2mmol/ml浓度；④乙酰辅酶A溶液：用Tris-HCl缓冲液进行配制，使成8mmol/ml浓度，临用前新鲜配制；⑤CAT（肉毒碱酰基转移酶）溶液：用Tris-HCl缓冲液将酶原液稀释30倍，临用前新鲜配制；⑥肉毒碱标准液：取L-肉毒碱一定用量，Tris-HCl缓冲液进行配制，配成8mmol/ml浓度，临用前稀释80倍成0.1mmol/ml浓度的应用液。
3. 操作步骤
（1） 取精浆0.15ml加95%乙醇0.15ml混匀，室温放置2小时后，3000r/min离心20分钟，取上清液在40℃下减压蒸发至干燥。
（2） 干燥物溶于3ml蒸馏水中，加4ml氯仿-异丁醇混合液，混匀，5分钟后，3000r/min离心20分钟，取上层水液2ml于试管中，在40℃下减压蒸发至干燥，备用。
（3） B-空白管、U-样品管、S-标准管
续表
混匀，置水浴37℃，30分钟后，于412nm波长读取吸光度。根据标准曲线求出精浆肉毒碱含量。
（4） 标准曲线的绘制：以肉毒碱含量100、200、400、600、800mmol/ml为标准点和所测吸光度回归绘制标准曲线。
4. 参考值
461.5±191.63mmol/ml。
二、 前列腺功能指标
精浆中的锌、枸橼酸和酸性磷酸酶的含量是前列腺分泌功能可信的检测方法，这些标志物之间存在很好的相关性。
（一） 精浆酸性磷酸酶检测 1. 实验原理（P-硝基酚磷酸法，WHO推荐方法）
酸性磷酸酶在酸性条件下分解P-硝基酚磷酸=钠产生色原性物质P-硝基酚（PNP），通过测定PNP浓度来确定酶活力的高低。
2. 试剂
①枸橼酸缓冲液（0.09mol/L，pH 4.8）；②6mol/L氢氧化钠溶液；③P-硝基酚磷酸（底物）溶液；④50mmol/L P-硝基酚（PNP）；⑤12g/L硫酸氢钠（NaHSO 4•H 2O）。
3. 操作步骤 （1） 预处理：
①液化后，以3000r离心10分钟，分离，将精浆20μl与硫酸氢钠20μl混合；②将精浆稀释1000倍待测。
（2） 操作程序：
在405nm波长，读取光密度。
（3） 标准曲线制备
将试剂盒内提供的标准品按照说明书要求加入相对应的试管，加完试剂后，立即充分混匀，用405nm波长、0号管调零，读取吸光度值，所得读数与其相应的酸性磷酸酶单位（依次为100、200、300、400、500U）回归绘制标准曲线。
4. 计算
1单位酸性磷酸酶=37℃下每分钟产生1μmol PNP，精浆中酸性磷酸酶活性=（测定管吸光度-空白管吸光度）/标准曲线斜率× 37U/ml，总活性=U/ml×1次射精的精液体积（ml）= U/1次射精。
5. 参考值：
≥200u/1次射精。
（二） 精浆枸橼酸检测 1. 实验原理
精浆去蛋白后，精浆枸橼酸可与吡啶、醋酸形成胭脂红色化合物，其显色与枸橼酸含量成正比。
2. 试剂
①TBA缓冲液（pH 7.7）的配制：14.9g三乙醇胺溶于750ml蒸馏水，加浓盐酸调pH至7.6；0.027g ZnCl 2必须完全溶解；加ZnCl 2溶液于三乙醇胺；加0.5g叠氮钠；②15%三氯醋酸（TCA）；③6mol/L NaOH；④NADH（还原性辅酶Ⅰ）；⑤枸橼酸裂解酶。
3. 操作步骤
①制备精浆：精液以3000r/min离心15分钟取精浆待用；②预处理：0.1ml精浆于4.95ml TCA中，加0.75ml氢氧化钠溶液（6ml/l），pH＞7.0，必要时可调为碱性，提取液必须清亮；③将0.5ml NADH溶液，2.3ml TBA缓冲液，0.2ml精浆提取液加在一个比色杯中，混合；④于340nm波长测吸光度A1；⑤加20μl枸橼酸裂解酶溶液，混合，并放置5分钟；⑥测吸光度A2。
4. 结果计算
枸橼酸浓度（mmol/L）=（A1-A2）/消光系数×提取稀释度×吸光度稀释度= （A1-A2）/6.3×58×（3.02ml/0.2ml）=（A1-A2）/139。
5. 参考值
≥52μmol/1次射精。
三、 精囊腺功能指标
果糖由精囊分泌，可用于鉴别单纯性输精管阻塞所致的无精症和输精管、精囊发育不良引起的无精症。
（一） 精液果糖测定（间苯二酚法） 1. 原理
利用Seliwanoff反应原理，间苯二酚与盐酸遇果糖产生红色化合物，在490nm与标准比色，求其含量试剂。
2. 试剂
①0.175mol/L ZnSO 4；②0.15mol/L Ba（OH） 2•8H 2O；③1g/L间苯二酚（雷锁辛）用95%乙醇配制；④10mol/L HCl；于87ml蒸馏水中加入HCl 413ml；⑤果糖标准液（50mg/L）。
3. 操作步骤
（1） 取精浆50ml，加蒸馏水1450ml，混匀，加0.15mol/L Ba（OH） 2 250μl、0.175mol/L ZnSO 4 250μl混匀，静置5分钟，3000rpm离心取上清备用。
（2） 间苯二酚法测定精浆果糖操作步骤。
90℃水冷10分钟，流水冷却，490nm，空白管调零，读取吸光度
（3） 计算：果糖（g/L）=（测定吸光度/标准管吸光度）×2
4. 参考值：0.87～3.95g/L。
（二） 精液果糖测定（吲哚法） 1. 原理
果糖与吲哚在强酸、加热环境中生成黄色化合物，该有色物质在470nm波长有最大吸收峰，其吸光度大小与果糖含量成正比。
2. 试剂
①1.8% ZnSO 4•7H 2O；②0.1mol NaOH；③吲哚试剂：溶200mg苯甲酸于100ml蒸馏水中，在热水浴（约60℃）中反复振荡，使之溶解，但所有苯甲酸都溶解后，再加入25mg吲哚，将此溶液过滤后4℃贮存；④果糖标准贮存液（2.8mmol/L）：溶50.4mg果糖于100ml蒸馏水中，冰冷储存；⑤果糖标准应用液：分析当天，将标准储存液分别稀释成0.28nmol/L和0.14nmol/L两种浓度。
3. 操作步骤
（1） 预处理：取0.1ml精浆加4.9ml蒸馏水1∶50稀释，取1ml稀释的精浆加0.3ml 1.8% ZnSO 4，混匀，再加0.2ml NaOH，充分混合后放置15分钟，2000r离心20分钟，取0.5ml上清液进行分析。
（2） 吲哚法测定精浆果糖操作程序。
续表
试管加塞后50℃孵育20分钟，冷水冷却至室温，470nm读取吸光度
（3） 计算：精浆果糖浓度（mmol/L）=（AS× 1/2×1.14/S+0.28/S2）×75
4. 参考值：
≥13μmol/1次射精。