精子作为雄性配子，在睾丸生精小管中产生，并经直细精管、睾丸网及睾丸输出小管，最后进入一个由高度盘曲的管道系统组成的器官——附睾，依睾头-体-尾运行，从而精子成熟，并暂存于附睾尾部（图6-1）。

哺乳动物的精子在睾丸可发育为高度分化的完整精子，但他们还不具备运动和使卵受精的能力，需要经过附睾头部、体部和尾部后，才能获得运动及受精的能力。在这一系列的过程中，发生了生理及形态方面的变化，称之为精子的成熟。但是低等脊椎动物及非脊椎动物的精子不需要经过变化，一旦离开睾丸，就具有受精能力。

从生殖生物学角度讲，精子在射精时进入阴道，通过宫颈、宫腔，到达输卵管壶腹部，与卵子相遇并结合，最终完成受精过程。这需要精子具有运动能力，特别是快速前向运动的能力，完成受精则须精子具有固着于透明带的能力，精卵识别能力和结合卵子的能力。

精子在睾丸中产生后，从形态结构及染色质角度看已基本成熟，但还不具备运动能力和受精能力，进入附睾后，沿着附睾头、体、尾运行和贮存的过程中，精子会进一步进行变化，形态结构、物质代谢和细胞膜成分都发生改变。精子通过附睾，获得运动能力、识别透明带能力、精卵识别能力和与卵子结合的能力，称作附睾内的精子成熟变化。

附睾精子成熟的概念是在20世纪20～30年代由Benoit和Young提出的。不过在当时并没有引起明显的反响，并且在接下来的一段历史进程中总是存在两种不同的观点：一种观点认为附睾精子成熟仅是一种时间因素，即认为所谓附睾精子成熟变化是随着精子在附睾运行的时间推移而产生的，另一种观点则认为附睾精子成熟是一个复杂的生理过程，附睾精子成熟主要受到来自附睾微环境的影响，当然也有着精子本身因素的影响。直到60年代Bedford和Orgebin Crist根据他们自己的实验再次明确提出附睾精子成熟的理论才得以重视，并在近20年期间附睾和附睾精子成熟的研究才有了较快的发展。1992年在香港召开了第一次关于附睾研究的国际会议“epididymis and male fertility”，1998年在澳大利亚召开了第二次关于附睾研究的国际会议“the epididymis，cellular and molecular aspects”。这两次国际会议集中展示了附睾和附睾精子成熟研究的新进展，同时也把人们对附睾的认识推向深入。

针对附睾和附睾精子成熟的研究具有重要意义，完全阐明附睾精子成熟机制在生理上会产生重要影响，在此基础上，附睾源性男子不育症的诊断和治疗才有可能进一步发展，更重要的是，针对附睾的男子避孕也会出现更多新观念、新突破。随着附睾研究的进展及人们对附睾精子成熟认识的深化，学界已认识到附睾是男子抗生育中最理想的靶器官，是男子抗生育研究的主攻方向和战略要地，这也可以达成人们的期望——功能性不育，指不影响睾丸精子发生，不影响男子生殖内分泌功能，不影响性功能，仅干扰附睾精子成熟，从而使其失去生育能力。

目前人工辅助生育技术的快速发展已经可以从睾丸取出精子进行单精卵内注射（ICSI）以达到受精，并用这种方法治疗某些男子不育症。但有的人据此提出是否还有必要进行附睾及附睾精子成熟研究，甚至有人认为根本不存在附睾精子成熟的问题。很显然提出这样问题的人是严重忽视了这样一个事实，利用ICSI技术达到受精是直接将精子注入卵子内，这一过程不需要精子的运动，也不需要精卵的识别和精卵的主动结合；而对绝大多数包括人类在内的哺乳动物都处在一个自然的生殖过程，都是在生理情况下进行生殖活动，精子必须在附睾中达到结构和功能上的成熟，必须获得运动能力，必须获得精卵识别能力和结合能力。因此当前应进一步加强附睾与精子成熟研究。

精子的形态结构在附睾运行过程中要发生进一步变化。这些变化主要包括精子线粒体改变、胞质小滴的移行、精子内胞质进一步减少及精子顶体的改变。进入附睾头部的精子，其线粒体经常大小不一，基质密度较低；移动至附睾尾部时，其线粒体大小逐渐趋向一致，基质电子密度升高。

睾丸精子胞质小滴主要位于精子中段的近端，靠近精子的头部。在循附睾运行过程中，精子的胞质小滴逐渐向末端移动，直至最后脱落。在胞质小滴移行的过程中，精子鞭毛中段会变得弯曲，这与精子的运动密切相关。如果胞质小滴未能完成移行和脱落，这种精子就未达到成熟，将影响其受精能力，如果在射出精液中存在大量有胞质小滴的精子，就可能造成男子不育，同时也表明在这种人的附睾中存在不利精子成熟的因素，反之，如果能阻止附睾内精子的胞质小滴移行和脱落，就能在不影响精子发生、性欲和射精过程的前提下，达到抗生育的目的。

附睾精子胞质小滴的移行和脱落也存在种属差异，有人通过透射电镜发现在美洲骆驼附睾中，胞质小滴的移动是在附睾体部远端完成，并且观察到在胞质小滴的移行过程中，存在类似精子鞭毛中段弯曲的特征；而在猕猴精子的附睾移行过程中，胞质小滴向尾部移行，并且注意到胞质小滴的移行与精子运动密切相关。

在附睾精子成熟过程中，附睾精子顶体形态和表面积也发生改变，表现为表面积逐渐缩小，顶体内容物密度逐渐提高，顶体内的前顶体素和顶体素也进行了再加工和降解修饰。在Tammar沙袋鼠中，睾丸精子80%以上具有一个大的未成熟顶体，而到达附睾体部，仅2%呈现未成熟状态，到了附睾尾部，未成熟型顶体则完全消失。这种变化也广泛见于灵长类。另外，前顶体素和顶体素作为顶体重要内容物，在附睾成熟过程中也进行了再加工和降解修饰。

精子发生过程中，生精细胞核内蛋白的组分发生了明显的变化，富含赖氨酸的体细胞型组蛋白被睾丸特异性组蛋白，即富含精氨酸和胱氨酸的鱼精蛋白代替。睾丸精子进入附睾后，其核蛋白组分一般不再发生变化。但在成熟过程中，精子核DNA与鱼精蛋白的结合越来越紧密，故表现出精子核DNA细胞化学染色，如Feulgan DNA染色不断减弱。不过这并不反映精子DNA含量有什么改变，而是鱼精蛋白和DNA链中的磷酸基团结构紧密。鱼精蛋白与DNA紧密结合对DNA有保护作用。

精子成熟过程中结构的另一重要变化是鱼精蛋白结合巯基量逐渐减少而二硫键量不断增加，这是由于鱼精蛋白内和分子间的巯基逐渐被氧化成二硫键，其结果是使精子核更趋稳定，对精子核和基因起保护作用，免受有害因素的损害。

在精子鞭毛的中段和主段存在9根外周致密纤维，占鞭毛全长的60%长度，其中第1第5及第6根最长最粗，而第3及第8最短最细，并与纤维鞘的横肋相联系。外周致密纤维形成于精子细胞期，这时大量摄入锌，因此锌主要位于鞭毛，特别集中于外周致密纤维，这时锌和半胱氨酸的硫氢基相联，形成一个复合物，能防止硫氢基氧化成二硫键。研究发现在附睾运行过程中，精子锌减少了60%，主要减少于鞭毛，特别减少于精子外周致密纤维，这表明外周致密纤维在达到功能上的成熟前，在化学结构要发生明显的成熟变化，这主要通过硫氢基氧化成二硫键失去了大部的锌，而使外周致密纤维稳定性增加。这一变化可能和精子运动能力获得有关，它使外周致密纤维坚硬的特性，变得柔和。外周致密纤维的结构变化可影响精子运动方式，甚而可能与精子前向运动的产生有关。

正常情况下，精子膜是精子功能得以实现的物质基础。精子在附睾移行过程中，其细胞膜发生一系列成熟变化，包括膜转运能力及膜荷电性改变、膜蛋白、膜脂和膜糖基的更新和调整。

精子在附睾内的成熟过程中，细胞膜的转运能力发生了较为巨大的变化，主要表现为主动转运机制加强。精子从睾丸网进入附睾时无排钠能力。随着精子在附睾内的逐渐成熟，精子获得排钠功能并且可以逆浓度梯度摄取钾离子，形成精子内的高钾低钠环境。当精子成熟后，精子细胞膜摄取某些化合物的能力更强，比如可以利用更多的6-磷酸果糖产生乳酸盐。Schweisguth等用一些去污剂诱导受低渗膨胀的附睾头部和尾部精子破裂，结果发现附睾头部未成熟精子比尾部成熟精子更易受到破坏。其他有关研究也表明在附睾精子成熟中，精子膜通透性有所降低。

精子膜通透性变化不仅可影响到精子内离子浓度的改变，并且也可影响精子酶的活力及其代谢，这些对附睾精子运动的活动发育和运动能力的维持有较大意义。

附睾上皮能分泌唾液酸，附睾液中的唾液酸的量按附睾头-体-尾逐步上升，附睾尾唾液酸最高，而附睾精子膜上的唾液酸则相反。我们的工作明确的反映了这种变化，附睾头、体、尾各组唾液酸量均数间有显著性差异。这是由于糖基转移酶和糖苷酶共同作用的结果；糖基转移酶能将新的糖基转移到精子表面糖蛋白的糖链上，而糖苷酶则能将表面的末端糖基除去。

唾液酸是一种带强烈负电荷的酸性糖蛋白，为精子表面负电荷的主要来源，在附睾精子成熟过程中，精子膜表面负电荷逐渐减弱。精子膜负电荷可以使精子在附睾发育成熟过程中，由于同性电荷相斥作用而不发生凝集反应，为精子构成一个良好微环境。在精子膜表面存在一些特异性抗原，唾液酸糖蛋白能遮盖这些抗原，从而在男子生殖道和进入女性生殖道后免遭免疫活性细胞识别和吞噬；如果精子表面失去唾液酸，精子在进入女性生殖道后可为巨噬细胞所吞噬。精子顶体前区浆膜富含唾液酸糖蛋白对保证精子结构高度稳定及完整的作用很大，而在附睾头-体-尾运行过程中膜唾液酸量的不断降低也与精子受精能力建立必要的膜分子构型相适应，为精子在女性生殖道的获能及精卵结合做必要的准备。表面呈低负电荷状态的精子的精子膜容易和卵子相识别，从而有加速受精过程的作用。

凝集素是一种能特异识别糖基并与之可逆结合且可引起靶细胞凝集的非免疫球蛋白性蛋白质。正因这些特性，目前常把凝集素作为一种细胞膜的探针来研究细胞膜表面糖基的分子组成和排列顺序，如麦芽凝集素（WGA）可特异性结合N-乙酰葡萄糖胺，蓖麻凝集素（RCA）能与β-半乳糖有专一性结合，大豆凝集素（SBA）可与N-乙酰半乳糖胺特异性结合，花生凝集素（PNA）也可与β-半乳糖-乙酰半乳糖胺结合。大量研究表明，精子膜表面存在众多凝集素受体即存在众多糖基。尽管不同种类动物精子膜糖基的类型，分布和变化均有差异，但对同一种动物来说，在附睾运行过程中，精子膜上的凝集素受体发生了一些规律性的变化。王一飞等用四种辣根过氧化物酶标记的凝集素（麦芽凝集素WGA、大豆凝集素SBA、花生凝集素PNA、刀豆球蛋白ConA）观察了人和五种哺乳动物（兔、犬、猴、大鼠和小鼠）附睾精子在成熟过程中的变化，发现附睾头部精子染色强，体部精子染色减弱，尾部精子染色最浅，表明这种凝集素受体在成熟过程中减少了；这与Nicolson等人的结果基本相一致，他们发现WGA和RCA与精子的结合从附睾头部到附睾尾部，直至射出精子都是逐渐减少，减少的主要区域是顶体区，而ConA则几乎不变；但Gordon和Lewin等人的研究观察到在附睾精子成熟过程中，ConA受体在顶体区增加。这可能由于具体研究方法的不同，结果不尽一致，但一般认为精子在附睾成熟过程中一些凝集素受体减少了，另外一些凝集素受体则增加了，其变化主要集中在精子头部顶体区。基于精子膜糖基在获能及精卵识别中的作用，附睾精子成熟过程中，精子膜凝集素受体的变化是有重要意义的，并认为精子膜表面凝集素受体变化可能涉及下列四种机制：①由于糖基转移酶的作用，使凝集素受体转移，原有的受体消失，产生新受体；②糖苷酶蛋白酶水解精子膜糖蛋白；③附睾上皮分泌物覆盖凝集素受体从而使凝集素不能识别，如使精子膜流动性变化，使精子膜糖蛋白重新分布；④精子膜凝集素受体立体构型发生变化，糖基或被暴露或被掩盖。

有关直接研究精子在附睾成熟过程中膜流动性改变的报告比较少，但一般认为随着在附睾中的运行，精子膜流动性是逐步降低。有人用1，6-二苯基-1，3，5-乙三烯（DPH）作为亲脂探针，观察到荧光偏振值在未成熟精子最低，尾部成熟精子最高，以此表明精子在附睾成熟过程中，膜脂流动性有很明显的下降。张君慧等用两种脂肪酸自旋探针（5DSA，16DSA）分别标记膜表层和膜深层，在电子自旋共振（ESR）波谱仪上研究观察大鼠附睾头体尾各段精子的精子膜膜脂流动性，发现精子从附睾头部到附睾尾部，精子膜表层和深层序参数逐渐增大，精子膜越来越有序，流动性越来越小。

一般来说，生物膜膜脂的流动方式和流动的强弱取决于膜内磷脂分子内部结构和胆固醇的含量，及膜蛋白分子的影响等，从附睾头部至附睾尾部，精子膜中由于新成分的插入或原有成分的丢失，其组成和结构发生了变化；首先在精子膜上膜脂的总量逐渐减少；并且随着精子的逐渐成熟，胆固醇、磷脂比率，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸比率明显提高，这些膜脂成分的改变造成了精子膜脂流动性随精子成熟而下降，这是符合细胞生物学的一般规律的，在膜结构中，胆固醇分子散布于磷脂分子之间，其极性头部紧靠磷脂分子的极性头部，其强硬的板石状甾环结构则使相邻的磷脂烃链的一部分不易活动，通过这种影响，胆固醇对膜的稳定性发挥重要作用。因此精子膜胆固醇成分的增加可降低膜流动性，另磷脂烃链长度增加和饱和脂肪酸的增加也可影响磷脂分子的相互位置，降低膜的流动性。

通过膜脂成分和结构的改变，使附睾成熟精子膜的流动性减少，稳定性增加，其结果是精子膜保持适当流动性，这对精子功能尤其是对精卵结合无疑是十分重要的。

在附睾精子成熟过程中，精子膜蛋白组成发生了重大改变。这些改变或是在运行过程中加进了新的蛋白质成分，如大鼠精子增加了31kDa、32kDa、34kDa和37.5kDa的膜蛋白，或是失去了原有的某些膜蛋白组分，如大鼠附睾头精子有110kDa、94kDa、72kDa和59kDa的膜蛋白，而尾部精子则失去了这些蛋白质。精子膜蛋白的变化也呈现出一定的规律性即高分子量蛋白质逐渐消失，低分子量蛋白质逐渐增多，低糖基化转为高糖基化。产生这些变化的主要原因为：①附睾上皮合成和分泌的蛋白质附着或掺入精子膜；②原有蛋白质丢失或者修饰；③附睾糖苷酶、蛋白酶作用于精子膜蛋白，使其降解，糖基转移酶使膜蛋白再次糖基化。精子膜蛋白的变化和精子的运动功能密切相关。精子细胞膜表面蛋白重修饰产生的新蛋白质和精子的前向运动、精子表面膜抗原性的变化以及获得受精能力有关。蛋白质磷酸化和精子运动调节有关。

精子膜成熟变化的另一特点是在附睾头-体-尾运行过程中精子膜上的硫氢基逐渐被氧化成二硫键，换言之，精子膜的硫氢基减少，二硫键增加。童明汉等应用人工合成的-SH基特异荧光探针标记物的单溴二胺（mBBr）和荧光显微镜观察到随着在附睾中的运行，精子荧光呈明显减弱趋势，荧光阳性率降低，用mBBr标记和流式细胞仪也显示了相同的规律。精子膜的这一成熟变化是精子膜成熟的重要特征之一。由于二硫键键能很大，它可把不同肽链或同一肽链的不同部分连接起来，对稳定膜蛋白起重要作用。

值得指出的是在大鼠的研究中，精子沿附睾头-体-尾运行过程中—SH转变为—S—S—键的变化是部分性的，意即在同一个精子的膜上也是有部分—SH基氧化成—S—S—键，同时还可能有一些精子未发生这种变化。推而广之，精子的种种成熟变化所发生的部位也不相同，有的发生于附睾头部，有的发生于体部，而有些则发生于附睾尾部，还有的可能在附睾头-体-尾全长都发生。为此笔者提出附睾成熟变化异质性的概念来概括附睾精子成熟变化的这些特点，此外笔者认为从生理角度看，附睾精子成熟变化也可能有一个度的概念，即在一定范围内，附睾精子成熟变化和其功能是相一致的，如附睾精子膜—SH转变为—S—S—键的成熟变化和大鼠精子运动发育有关，但附睾精子贮存于尾部过长，—SH转变为—S—S—键的变化将继续进行，超过一定限度则对精子运动不利，而可能会导致精子的老化。

中国科学院动物研究所段恩奎研究组发现，哺乳动物成熟精子中有一类进化上保守，来源于tRNA 5’端序列且高度富集在30～34nt的新型小RNA——tsRNA （tRNA-derived small RNA），这种tsRNA可作为一种父源信息在受精时进入卵子。随后进一步发现，tsRNA可通过序列上的核酸修饰维持其稳定性，且在机体应激等情况下发生敏感变化，故推测tsRNA及其RNA修饰可能作为一种表观遗传信息的载体，将环境诱导的获得性性状经配子（精子）传递到子代。段恩奎等人发现tsRNA的富集可能与晚期精子发生（如附睾精子成熟过程）中特定tRNA的增殖以及选择性聚集有关，具体机制尚不明确。

进一步研究发现，肥胖小鼠精子RNA中可能携带有传递父代获得性性状的表观遗传信息。父代肥胖小鼠模型中精子tsRNA对于代谢紊乱表型的传递是必需的。

检测发现，注射肥胖小鼠精子tsRNA的早期胚胎以及后代小鼠胰岛的转录组发生了明显变化，变化基因集中在代谢通路上。但这些变化与基因CpG岛的DNA甲基化程度并不相关，提示精子tsRNA的作用并非通过调节DNA甲基化来实现。总的来说，此项研究从精子RNA角度出发为研究获得性性状的跨代遗传现象提供了全新的视角，未来关于精子tsRNA及其修饰谱在早期胚胎发育调节中的作用机制将是领域内亟待解决的关键问题。

附睾中精子成熟最明显的变化之一是精子获得运动能力。众多研究已证明正是在附睾从头-体-尾的运行过程中，精子才获得了运动能力，特别是快速前向运动能力。附睾精子运动能力的发育是有一过程的，一般的规律是从不动到能运动即运动的启动，开始常表现为原地转动，这是一种无方向性的运动，然后发育为定向运动，速度也从慢速至快速直至发育为快速前向运动。

传统的附睾精子运动分析靠主观的定性和粗略的估算，缺乏精确和客观的定量指标。随着计算机和光学技术的快速发展，计算机辅助精子分析技术（CASA）应运而生。这种技术方法快速客观，能精确定量并能具体分析精子动力学参数，包括精子运动速度和运动方式，而这些均可由精子的活力参数和运动方式参数表示（图6-2，图6-3）。

具体包括：

（1）精子运动路径速度VAP以精子头为被视察物，沿着其行走的平均路径速度。这个路径是指经计算机将精子运动的实际运动轨迹数字平均处理后的轨迹曲线。

（2）轨迹速度VCL精子头部沿着其实际行走轨迹的路径速度。

（3）前向运动速度VSL是精子头部的位移速度，即起点和终点之间的直线速度。

（4）摆动频率BCF精子头部跨越精子运动路径频率。

（1）线性度LIN，即VSL／VCL，测量精子运动轨迹的直线分离度。

（2）直线性STR，即VSL／VAP，测量精子运动路径的直线分离度。

（3）头部侧置幅度（ALH），以精子运动路径为基础的精子头部最大侧置量。

（4）平均角移位（MAD），精子头部运动轨道的瞬间转角平均时间绝对值。

Claudine Mathieu、CH Yeung及吴立君等人对人附睾不同部位的精子运动进行了定量观察和分析（表6-1）。

从这几位研究者的结果看，三组人附睾各段精子运动能力发育的测试结果有些差异但是有一点是很明显的一致，即附睾头部精子表现出很弱的运动，速度慢，线性也很差，到了附睾体部，精子运动明显增强，表现速度和直线性都有十分明显的提高。这种在人类附睾精子成熟过程中所表现出的精子运动能力发育在其他动物上也有充分的体现。吴立君等分析了家兔、大鼠以及小鼠附睾各段的精子运动（表6-2）。从这些结果看到，精子在附睾中运动能力是伴随着精子成熟过程而获得发生并得到发展的，但是在不同种属动物之间，其运动的发生和发展具有一定的差异，附睾尾部的精子运动能力（包括运动速度和直线程度）最强，这点也证明了精子运动能力的获得和发展是附睾精子成熟的结果和成熟的重要表现。各种不同种属动物精子在各自附睾成熟过程中，其衡量运动能力的两个方面参数——活力（运动速度）和运动方式的发展是不平行的。例如，家兔、从附睾头部到体部，精子运动重要增加的是其直线性，而从体部至尾部却主要是运动速度的增加。大鼠附睾头部和体部精子运动情况基本相似，但到了尾部，精子运动速度和直线性均有明显增加，其运动包括活力和运动方式的主要发展表现在附睾体部到尾部的过程中。小鼠从附睾头、体、尾移行过程中运动速度逐渐增加，而直线性的增加仅表现在从体部到尾部的过程中。

与附睾精子运动能力获得和发育的相关因素很多且很复杂。目前总括起来可以归结为4个方面：①精子附睾成熟运行过程中的结构变化影响，如精子鞭毛的结构包括巯基的变化；②附睾精子的能量系统发育，如精子线粒体功能、精子的糖代谢、肉毒碱以及ATP等；③精子细胞信使系统，如钙离子、钙调蛋白以及cAMP等；④附睾液中的某些离子成分的影响。这些因素间存在复杂的相互作用关系。

精子能够运动，从结构上讲，是由于精子尾部鞭毛以及鞭毛内轴丝中微管间的相对滑动。鞭毛中，外周致密纤维可通过影响精子尾部的弹性而影响精子的运动方式。附睾精子成熟过程中，精子多种结构上的二硫键增加，其中精子尾部致密纤维和纤维鞘二硫键的增加与附睾精子运动发育有关。外周致密纤维在鞭毛运动中与精子尾部被动的弹性回缩有关，外周致密纤维的物理性状与精子摆动形成的弧度的曲率半径有关。从附睾头部到附睾尾部的精子成熟过程中，外周致密纤维上的巯基逐渐被氧化成二硫键可使其更稳定，从而有利于精子的运动，有利于精子的前向运动；另外附睾精子成熟过程中精子膜结构的变化所造成的膜渗透性及通透性的改变可引起精子内代谢物质，特别是一些离子成分的改变，从而也参与附睾精子运动发育的调节。

附睾精子运动的启动与发育与附睾精子自身能量系统发育密切相关。

精子线粒体鞘是精子的供能中心，因此线粒体功能发育对附睾精子运动发育影响很大。LDH-X是存在于精子并位于线粒体中的特异酶，是与精子能源供给相关的主要酶系之一，其活性在一定程度上反映了精子线粒体的功能。研究发现在大鼠附睾精子成熟过程中该酶活性逐渐增强。附睾体部精子明显高于头部精子，差异显著，而尾部精子和体部精子差异不显著。这可能提示附睾体部精子线粒体功能已得到了很大程度的增强和足够的发育，这与附睾体部精子已表现出活跃的运动能力是相一致的。

附睾液内存在高浓度的肉毒碱，其含量要高于血中浓度上千倍。目前已清楚附睾液内高浓度的肉毒碱来自于附睾外组织，通过血运到达附睾，附睾上皮有摄取和浓缩肉毒碱的能力，而附睾精子再从附睾液中摄取和积聚肉毒碱。肉毒碱在精子线粒体的脂肪酸β-氧化过程中起有着重要作用，主要是携带脂肪酰基通过线粒体膜，反应产生的乙酰辅酶A可进入三羧酸循环，产生的ATP供精子运动所需。研究表明附睾体部精子和附睾尾部精子中的肉毒碱明显高于附睾头部精子。应当指出外界过高浓度的肉毒碱则对精子运动有抑制作用，附睾尾液高浓度的肉毒碱对运动发育充分精子使其在尾部保持静息。

ATP是精子运动发生发展的主要能量来源，精子运动依赖于精子代谢过程中足够的ATP产生能力和对ATP有效利用能力。附睾精子在循头-体-尾运行过程中，其中产生ATP的量逐渐增加，附睾尾部精子ATP含量与附睾头部和体部精子ATP含量间差异高度显著，附睾体部精子ATP含量与附睾头部精子ATP含量间差异显著。附睾精子内ATP的这种变化为附睾精子运动能力的获得和发展提供了充分的物质保障。

附睾精子成熟过程中，精子运动能力的获得和发育受细胞信使系统的调控。目前认为Ca ²⁺、钙调蛋白、cAMP，磷酸二酯酶抑制剂及细胞外低浓度ATP非能量调节作用等。有关研究工作证实了它们的调控作用（表6-3）。

有研究表明，人类防卫素家族（human β-defensin，DEFB）对小鼠和人类精子的运动能力有调控作用，小鼠精子中的精子相关抗原（sperm associated antigen 11，SPAG11e），以及人类精子中的人类防卫素1（human β-defensin 1，DEFB1）协同趋化因子受体6（chemokine receptor type 6，CCR6）都能增强精子的运动能力，其原理均为提高精子中Ca ²⁺的浓度。在小鼠中，SPAG11e甚至能够使无运动能力的精子逐渐恢复运动能力。EDFB家族中的DEFB15被证明同样能影响精子的运动能力，但不会影响精子获能和顶体反应。研究表明，DEFB1，2，9，10，11，13，15，35和50在小鼠中均和小鼠精子运动能力有关，但敲除DEFB1后，小鼠的生育能力并没有受到明显影响。而在人精子中，DEFB1及其配体CCR6能增强精子运动能力。

Ca ²⁺不仅在细胞中起兴奋-收缩耦联作用，而且在细胞的运动、分泌、代谢和分化等基本过程中发挥第二信使作用。Ca ²⁺对精子的调节作用是通过对精子内Ca ²⁺浓度的改变和分布的变化来实现的。影响Ca ²⁺浓度和分布变化的因素很多，如精子膜上的钙泵，一些非离子选择性通道和特异性Ca ²⁺通道，特别是存在于精子膜上的特异性Ca ²⁺通道起重要作用。精子膜上Ca ²⁺通道主要有电压门控通道（voltage-gated calcium channels，VGCC），环核苷酸门控通道，孕激素受体通道等。Ca ²⁺影响哺乳动物精子运动可通过对鞭毛轴丝的作用来完成；另Ca ²⁺对轴丝影响还可能通过钙调蛋白起作用。

钙调蛋白是精子重要的酸性糖蛋白，在整条鞭毛中均发现有钙调蛋白存在。而在附睾体部精子内钙调蛋白活性最高。钙调蛋白在Ca ²⁺存在条件下参与了精子鞭毛微管的拆卸和装配，同时也可刺激磷酸二酯酶的活性，加速对cAMP的分解，这也就解释了为何附睾体部精子钙调蛋白浓度很高，而cAMP的浓度比较低的现象。

有关研究观察到附睾液中的ATP能影响尾部精子的运动，并且能使细胞外无钙环境造成的制动精子出现运动。其作用机制可能是通过与精子膜上的G蛋白耦联的PIU受体调节IP3通路，刺激精子钙库中Ca ²⁺释放，引起精子内Ca ²⁺重新分布，调节精子运动。细胞外ATP在刺激附睾精子运动的同时，又可增加精子内cAMP和游离Ca ²⁺浓度。

在附睾精子运动发育过程中，细胞信使不是相互独立和孤立地发挥作用，而是相互间存在密切的关系，发挥着信使系统的整体调节作用。另据研究附睾腔中的ATP除附睾上皮细胞分泌外，部分可能由睾丸支持细胞分泌，从这里推测睾丸也以此种方式部分地参与附睾精子运动的发育和成熟的调控。

钾离子、氨离子、钠离子和离子载体所导致的对精子前向运动的影响和抑制精子的活动力，现在认为主要是引起精子内pH的改变所致。有实验表明，去膜精子最适的是碱性环境。另外，有学者认为，高钾的抑制作用可能与其促进了精子的脂质过氧化作用有关。附睾尾部高钾的环境可能就是精子附睾尾部静息状态的原因。

精子对细胞外钙离子的耐受性很大，除非是精子外无钙或高钙环境。这也从一个侧面反映了精子主要是依赖了自己内部的钙离子，由其钙库-线粒体对钙离子的释放和摄取引起的精子内钙离子重新分布进行调节。精子外钙离子有可能通过激化腺苷酸环化酶起作用。外向的钙-ATP酶和在精子细胞膜上发现的钙钠交换系统，有可能协同了精子线粒体摄取钙的作用，使精子胞质内钙离子减少。

精浆中获得的前向运动蛋白是附睾来源的。它的主要作用是启动精子的前向运动。对于FMP的作用机制，一些学者通过大量的实验也得到了一些初步结果。

首先，FMP能减低未成熟精子摄取细胞外钙，从而启动了精子的前向运动。由于精子成熟过程中从绕圈变为前向运动与精子内钙减少一致。用①细胞外高钙浓度；②加入乙酰胆碱酯酶抑制剂；③局部麻醉剂和钙离子转运抑制剂；④钙调蛋白拮抗剂均可使前进的成熟精子变为绕圈运动。减低了精子内的钙离子浓度可促进仓鼠附睾头部精子的前向运动。

其次，FMP可能通过对精子膜表面泵的作用而减少精子内钙离子。与此相类似的有精浆中存在一种钙精液蛋白（calsemin），它可促进静息状态的成熟附睾尾部精子的运动，与射精时精液中精子暴发的活跃运动有关。它也同时刺激了精子向外转运钙的ATP酶。

此外，FMP对未成熟精子前向运动的启动（如人附睾头部精子），一般要在磷酸二酯酶抑制剂如茶碱等的协同下进行。但在一些动物，如兔睾丸精子、猪睾丸精子或大鼠和羊的附睾头部精子，FMP在磷酸二酯酶抑制剂同时存在的条件下，并未能发动其前向运动。这可能表示要对上述因素有反应，还需精子先在近侧附睾进行某些其他的变化，如精子内pH，以及其他反应物的准备。

受精过程是精卵相互作用最终形成受精卵的复杂过程，包括对透明带的黏附、识别和穿透，精卵识别，精子的穿入和精卵的融合等。研究表明，精子的受精能力是在附睾运行和贮存过程中获得和发育的，是附睾精子成熟的核心。

附睾精子受精能力获得和发育的研究是Bedford和Orgebin-Crist于1967年首先在兔上进行的。他们采用结扎方法使附睾精子不能循附睾头体尾进行运行，而只能停留在附睾近中段。虽然近中段附睾精子能存活，但却无受精能力。随后上述两位学者和其他科学工作者对狷猴、猪、羊、小鼠、大鼠、田鼠等附睾精子进行了系统研究；在人类也发现大部分附睾精子进入到体尾部的过程中获得了受精能力。而在附睾管阻塞或缺失时，近中段部分的精子仅一小部分具有受精能力。至此，对包括人在内的附睾精子受精能力获得的部位基本清楚（图6-4）。

人类精子在从附睾头部进入到附睾体尾部时，大部分获得了受精能力。附睾头部的精子具有潜在的与透明带结合的能力，但结合位点或被遮盖，或未集中分布，没有与细胞内效应器形成功能统一体。在附睾内的运行过程中，精子表面的蛋白质发生了分布及结构变化，顶体素、前顶体素也发生了再加工和降解修饰。

为了使卵子受精，精子必须获得和发育运动能力。附睾精子受精能力的发育已得到证实，但受精这是一个十分复杂的过程，涉及很多环节。因此附睾精子受精能力的发育也不会是单一的变化。近年已有不少研究工作，特别是一些分子生物学的研究工作正在提示出附睾精子受精能力获得和发育的机制及其本质。

精子受精能力的获得和发育首先表现在精子对卵丘细胞层的穿越作用。长期以来，人们却忽略了精子对卵丘细胞层的作用。近几年来研究发现，精子头后部具有透明质酸酶活性的膜蛋白PH-20，协助精子穿透卵丘细胞层。PH-20是一种单链蛋白质，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）固定在精子膜上，该分子N端具有透明质酸酶活性。其透明质酸酶活性在协助精子穿透卵丘细胞过程中发挥重要作用。如果PH-20蛋白被透明质酸酶抑制剂和抗氨基端活性部位的抗体封闭，精子就无法穿过卵丘细胞层。PH-20能使顶体完整的精子穿透卵丘细胞层。虽然PH-20蛋白是在精子发生过程中形成，并分布于精子头部，但在附睾精子成熟过程中PH-20蛋白的定位发生了变化，主要定位于精子头后部质膜和顶体内膜，后者PH-20蛋白的量是前者的两倍，浓度明显增高。PH-20蛋白在精子膜上的重新分布和浓度变化在受精起始阶段有着十分重要的作用。

穿越卵丘细胞后所发生的精子对透明带的黏附和识别也十分重要。这种黏附和识别主要是精子表面的糖基和透明带的糖基结合蛋白ZP3之间的结合，该能力是在附睾中获得的。参与人精子透明带识别的有P34H蛋白等。P34H蛋白由附睾尾部上皮细胞分泌，定位于人精子顶体帽区，最初出现于附睾头部的精子，精子从附睾体到附睾尾的运行中该蛋白逐渐增多，射出的精子则很少，获能后又恢复，顶体反应后消失。P34H能够介导精子和透明带的结合。部分不育患者P34H水平低于正常人，其精子透明带结合率也明显下降。

在精卵结合过程中，存在于精子和次级卵母细胞上的蛋白质复合物有结合和融合作用，一些精子表面的蛋白在附睾内完成了再加工，有些附睾分泌的精子结合蛋白参与了精卵细胞膜融合过程。

精子膜融合蛋白或受精素（fertilin）在精子膜蛋白与卵细胞膜的融合中可能起着关键作用。Izumo蛋白是2005年发现的与精卵融合相关的精子膜蛋白，Izumo蛋白主要在精卵融合过程中发挥作用而对精卵间的相互识别影响不大。受精素是最初发现的参与精卵融合的ADAMs家族成员，是受精素α和β的异二聚体，受精素α和β均为Ⅰ型膜镶嵌蛋白。fertilin主要位于精子头后部质膜或赤道板区，它由α和β亚单位构成。α亚单位是在睾丸精子发生过程中被酶切，而β亚单位则是在附睾运行过程中成熟。

虽然α和β亚单位的结构和氨基酸序列相近，但是它们的功能则有明显的差别。荧光标记的重组β亚基正好与卵母细胞表面的精子结合位点发生作用，体现为整联蛋白配体区顶端的TDE三肽结构与卵母细胞质表面的α6β1型整联蛋白结合，一旦去除整联蛋白的配体区，则β重组亚基的结合能力丢失。另外发现敲除编码β亚基整联蛋白第14外显子区，子代精子在体外黏附和融合去透明带卵母细胞的能力明显下降。

长期以来，人们十分关注着附睾上皮合成的蛋白质与附睾精子表面结构的关系，关注着在受精过程中的重要作用。不少学者将附睾上皮合成的并参与精子表面结构的蛋白质称为成熟抗原，其中有些蛋白质与精子受精能力的获得有关，在受精过程中发挥作用。

Kirchhoff等用分子生物学方法，研究了人附睾蛋白及其精子成熟过程中的作用。他们主要研究了HE1～HE6 6种附睾分泌蛋白，其中有些蛋白质可能与精子成熟及精子受精能力获得相关。另外，科学家最新发现了另一个附睾蛋白HongrES1。它们各自具有其独特的特点。

HE1可能与胆固醇转移有关。其编码的人附睾蛋白为分泌性糖蛋白，由附睾体部上皮细胞分泌，并在附睾尾液中积累，也大量出现于精液中。其主要功能是精子在附睾运行和贮存过程中，维持精子细胞膜胆固醇的量，可能是一种去获能因子，而在进入女性生殖道获能过程中，胆固醇从精子膜上漏出，因而精子膜胆固醇被稀释和散失。

HE2是起源于附睾头部的精子表面抗原。HE2的mRNA具有高度的附睾特异性，是一种新发现的人精子表面抗原，可能与精卵结合有关。

HE4的cDNA编码一种小分子量的酸性蛋白，来自于人远端附睾上皮。HE4可能是精子的一种新型去获能因子，与获能和受精过程有关。HE4属乳清酸性蛋白家族，是一种蛋白酶抑制剂，结构特征为由8个胱氨酸形成的四个二硫键桥。HE4在正常人的附睾，呼吸道上皮细胞及生殖道表达，在浆液性卵巢癌中有高表达，HE4目前已成为浆液性卵巢癌的肿瘤标记物。

HE5是分离筛选出的重要的人附睾基因产物。HE5是附睾分泌的小分子糖肽，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于附睾精子的细胞膜。精子膜表面HE5的表达，对精子膜表面糖衣的形成起重要作用。精子膜表面糖衣可以防止精子相互凝集，或非特异性地结合到生殖道上皮，同时还可以遮蔽精子膜抗原、稳定顶体膜，以防止顶体反应过早发生。此外，精子膜表面HE5的连接多糖与人类不育有关。在附睾远端，精子膜“糖衣”也是一种碳水化合物结构。同时发现这类碳水化合物的许多单克隆抗体能和精子结合，并能抑制受精。在一些不孕妇女中也能分离出这种类似的抗体。

HongrES1是一类新发现丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor，SERPIN）家族的一员，是附睾分泌的一种蛋白，受雄激素正调节的蛋白。张永莲院士发现，在体外实验中，用HongrES1特异性抗体与精子细胞共孵育会发现有明显促进精子成熟的功效。而用RNAi技术下调活体大鼠体内的HongrES1蛋白时，大鼠的精子成熟比例明显升高。然而，若用遗传技术将HongrES1基因剔除会导致大鼠的繁殖能力受损，导致子代胎儿畸形。

附睾精子成熟有异质性，只有部分附睾精子能获得运动和受精能力；同时，精子不同区域成熟变化也具有异质性，表现为精子局部膜流动性，膜蛋白构成的不同。

应当指出，附睾精子受精能力的获得和发育机制的研究还很不充分。近年来随着分子生物技术的迅猛发展，有一大批附睾特异表达的基因被相继克隆，但大多数基因的功能仍不十分清楚。随着对附睾特异表达基因的功能研究，将会发现更多与精子运动能力和受精能力相关的附睾分泌蛋白，有望进步一步阐明精子成熟和受精的分子机制。

附睾是十分盘曲而细长的上皮管道。生精小管汇合形成睾丸网，进而形成输出小管，根据不同的物种，4到20个输出管腔汇聚成一个高度连续的管道——附睾管。在小鼠中附睾管长约1m，大鼠3m，人3～6m，而马有30m长。

附睾通常分为四个区域，起始段、附睾头、附睾体、附睾尾。在所有的哺乳动物中，附睾的每个区域进一步由疏松结缔组织隔膜分隔成小叶。这些小叶不仅对组织有支持功能，同时小叶间也形成了功能上的分离，使蛋白和基因在单个小叶上选择性表达，从而构成了小叶特异的特殊微环境。

附睾中有几种上皮细胞类型，包括主细胞、顶细胞、狭窄细胞、亮细胞、基细胞、晕细胞和树状突细胞等（图6-5）。附睾各段的细胞分布是不同的，其中一些细胞分布在整个管腔，如主细胞，而其他细胞主要或特异分布在部分管腔，如狭窄细胞。这些上皮细胞有多种复杂功能，正是这些细胞的功能活动，构筑起了附睾精子成熟的微环境。

从与蛋白质合成和分泌的有关细胞结构来看，附睾上皮中主细胞、基细胞和狭窄细胞等细胞的核上区有比较发达的高尔基复合体，细胞内也有较发达的内质网以及较多的囊泡状结构，其中尤以主细胞为明显，这充分显示了合成和分泌蛋白质的细胞结构特征（图6-6）。

用标记氨基酸注射后，证实氨基酸能掺和至附睾管腔蛋白质，电子显微镜也显示示踪物从粗面内质网转移到高尔基复合体，再到微绒毛，然后出现于附睾管腔。

多数附睾合成和分泌蛋白质多在附睾头部近侧端开始，这可能与附睾头部主细胞数量有关。

通过电泳已经发现几百种附睾蛋白，蛋白丰度具有较广的动态性，有15～20种蛋白约占总蛋白的60%～80%，其中有乳铁蛋白，组织蛋白酶D前体，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），β-氨基己糖苷酶，甘露糖苷酶，半乳糖苷酶，前列腺素D2合成酶（PGDS），丛生蛋白，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（CRISP）以及附睾视黄酸结合蛋白（E-RAPB）。蛋白的组成不取决于管腔液的蛋白浓度，而是随管腔各段不断变化。这种变化是由于附睾上皮的两种活动导致的：分泌和吸收蛋白。在附睾的前部分，大部分来自睾丸的蛋白被输出小管吸收，如白蛋白、转铁蛋白、丛生蛋白和PGDS，吸收速率和种属相关。附睾后部一般只会吸收人中的白蛋白和转铁蛋白。

附睾分泌的蛋白质功能繁多，有不少蛋白质功能还有待阐明，但一般可将附睾分泌的蛋白质的功能分为两大类，一是非特异性功能，如通过附睾精子膜本体蛋白的相互作用和影响对离子的摄取，从而可改变精子膜的渗透性；有些附睾分泌蛋白是属于精子的生存因子，防止精子活动力的消失或延长精子的活动和生存时间；另一类是附睾分泌蛋白的特异功能，如附睾头部上皮细胞分泌的附睾糖蛋白（AEG）与附睾未成熟精子一起孵育，能增加精子固着于卵子透明带的能力和诱发近侧附睾头部精子的活动能力；附睾唾液酸蛋白则可能促进精卵结合，前向运动蛋白则可以激发附睾精子前向运动的产生等。

附睾上皮能分泌一些小分子有机物，如附睾上皮能将卵磷脂转变为甘油磷酸胆碱（GPC）。GPC也被认为是附睾精子的成熟因子之一，可能与维持附睾液的渗透压有关。

肉毒碱是在肝脏中合成的，随血液到达附睾。附睾上皮细胞主要是头部和体部的上皮细胞从血液中摄取肉毒碱并加以浓缩再分泌至附睾腔液中去。肉毒碱已被众多研究证明与附睾精子运动发育有关，同时附睾尾液中高浓度的肉毒碱有利于附睾尾精子保持静息状态。因此具有刺激精子运动发育和抑制运动的双重效应。肌醇是附睾上皮细胞分泌的第三个比较重要的小分子，其作用一般认为在于维持附睾上皮细胞和精子的生存。

附睾上皮细胞具有很重要的吸收和转运离子功能，其中附睾上皮对电解质和水分的转运为精子成熟形成一个良好的液态环境，反之则会造成种种病理损害，甚而引起男子不育。

正常情况下，附睾上皮通过对水和电解质的跨膜转运，重吸收绝大部分睾网液。由于附睾管与肾小管的胚胎起源相同，附睾上皮的这种重吸收功能类似于肾小管对水和电解质的重吸收，即伴随着对Na ⁺的吸收重吸收水分，如一只羊的睾丸每天产生40ml睾网液，到达附睾经附睾重吸收离开附睾时仅为0.4ml。

附睾的重吸收在各个不同部分是有高度选择性的，特别表现在对Na ⁺和K ⁺。睾网液和血浆一样，以高钠低钾为特征，而到了附睾液正好相反，表现为低钠高钾。附睾移行过程中附睾液内K ⁺／Na ⁺比率逐渐上升。

除了上述的浓缩作用外，在附睾移行过程中，附睾液pH有明显下降。在大鼠睾丸内pH为7.4，到了附睾头部则下降到6.5～6.6，在猪附睾管开始pH为7.2，到尾部则pH下降到6.5，这种现象被认为可能是碳酸酐酶及H ⁺和HCO ₃ ^-的转运作用引起的。由Na ⁺-K ⁺-2Cl ^-同向转运和Cl ^--HCO ₃ ^-交换介导的Cl ^-分泌（附睾液中最主要的阴离子），占了附睾整个阴离子分泌总量的2／3，而余下的另外1／3则是通过Na ⁺-H ⁺交换的HCO ₃-。

1926年Benoit的研究发现，附睾依赖于一个未知的睾丸物质来维持其结构和功能。这种调节物质五年后被确定为睾酮。

研究雄激素水平对附睾影响的主要方法是睾丸切除。但显然，这种方法不仅使雄激素缺乏，雌激素和其他可能对附睾有作用的睾丸因子也会消失。睾丸切除术导致附睾重量的下降没有其他性附腺如前列腺或精囊腺明显，而且附睾与其他雄激素依赖性男性生殖组织不同，即使用高于生理水平的睾酮替换，附睾重量也只是部分恢复。这是因为附睾很大部分（近一半）的重量来自精子和管腔液，在雄激素缺乏状态，精子的运动能力并不会发育，失去使卵子受孕的能力并最终死亡。对成年或青春期动物实行抗雄激素药物的治疗，例如氟他胺，会导致精子通过附睾的时间加快，精子的运动能力障碍和附睾尾部储存精子的能力下降。

在睾丸切除后，管腔直径和上皮细胞的高度减少，管腔间质增加，滑面内质网含量大幅减少，而高尔基复合体的下降程度是不太明显。而主细胞的形态学变化表明，相比于其他上皮细胞类型，主细胞对雄激素水平特别敏感。在雄激素缺乏状态下，主细胞的分泌功能受到损害。除了胞质内质网的消失，主细胞游离面微绒毛有大量的丢失，此外还有溶酶体贮积，空泡形成，细胞顶端囊泡消失和细胞内吞作用增加。附睾雄激素受体和5α-还原酶活性均在雄激素缺乏状态下下降，这表明由于雄激素撤退，雄激素作用机制受到抑制。附睾总蛋白以及RNA和DNA的含量在睾丸切除后减少，但DNA浓度明显增加，这是因为细胞体积同时下降，也被认为是在睾丸切除后附睾上皮退化的机制。

恢复到循环库的睾酮水平可以逆转附睾在睾丸切除后的退行性改变，但是用高于生理水平的睾酮，却不能逆转附睾在起始段的退化。相比于其他雄激素依赖性组织如前列腺和精囊，在附睾中，雄激素对所有类型附睾上皮细胞的有丝分裂影响较小，这种特征表明附睾上皮可能含有抗增殖信号，抑制细胞的增殖能力，从而针对雄激素或其他因子的刺激。而一个已知的抑制细胞增殖的转录因子B-MYC，在附睾上皮细胞中高表达。

通过睾丸切除使雄激素水平下降后，附睾起始段开始出现细胞凋亡，并在几天内延续到附睾尾。起始段的细胞凋亡可能是由雄激素和睾丸因子的缺失引起的。对整个附睾切除后发现，附睾上皮中的一个抗凋亡因子BCL-2在睾丸切除后被抑制了36小时，随后在第48小时出现凋亡相关因子（factor associated suicide，FAS）和DNA断裂。而FAS未突变小鼠在睾丸切除后没有表现出上皮退化或DNA断裂。这些数据表明睾丸切除后附睾上皮的衰退可能受到FAS通路的调控。

除了雄激素，还有许多其他激素因子已被推测在调节附睾功能中发挥作用。特别要注意的是雌激素。雄激素一方面在与5α-还原酶作用下形成双氢睾酮，另一方面也在细胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）的作用下形成雌激素，它有两种雌激素受体ER-α和ER-β，在各物种间的附睾头中均有表达，但在附睾的其他区域存在物种、细胞特异表达。男子血液中的雌激素浓度很低，但在精液中，雌激素浓度很高，在睾网液中高达250pg／ml，甚至高于女性血清中雌激素水平。CYP19A1在支持细胞中和间质细胞中表现出很强的活性，并存在于多个物种的生精细胞中。更有趣的是，有研究发现运动的精子中存在更加富集的CYP19A1。ESR1和ESR2属于细胞核受体家族，有着保守的但结构和功能不同的结构域，如DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD），雌激素和ESRS可以通过多种不同的途径进行信号转导，最经典的是DNA结合通路。最近的研究表明，雌激素可以上调附睾平滑肌中钙离子敏感的RhoA／ROCK通路，从而调节附睾的收缩。

一些启动子区含有雌激素或雄激素反应元件的基因在输出小管中表达，提示在特定上皮中需要雄激素和雌激素的平衡，如水通道蛋白（aquaporin，AQP），受雌激素和雄激素双重调控。AQP9在输出小管和附睾的特定上皮细胞中发现，对雌激素和雄激素表现出不同的反应。在Esrl ^-／-小鼠和氟维司群（ICI 182，780）治疗的兔子中AQP9染色显著减少，然而，雌激素或抗雄激素治疗，以及阉割或导管结扎术，会选择性地减少附睾中的AQP9，虽然附睾初始段中的亮细胞染色减少，但是在主细胞中并没有。在输出小管，阉割后DHT或睾酮和雌二醇共同刺激AQP9的表达，但是只有睾酮是无效的。而在附睾尾部，睾酮可以在阉割后恢复AQP9。在附睾起始段，DHT的代谢物5α-3α雄二醇也是有效的。这些结果归因于以下几个因素：输出小管高表达ESR1和ESR2和雄激素受体；附睾初始段5α还原酶的表达量最高，对DHT最敏感，而附睾尾对睾酮最敏感；ICI治疗后改变了上皮形态，减少了微绒毛，而AQP9定位于微绒毛上，因此在治疗后减少。所以，附睾各特异组织的基因调控取决于5-α还原酶的表达，AR和ESR1的存在或缺失，还有其特定的DNA反应元件。

除了依赖循环水平的雄激素，附睾也依赖于来自睾丸或本身的管腔液因子。在这些因子去除后，起始段会在24小时内开始凋亡。因此，输出小管结扎会导致附睾起始段的形态学和基因表达上的变化。虽然睾丸管腔液的类固醇、雄激素和雌激素对起始段的功能调控很明显，但有一些现象表明其他的因子也很重要。Fawcett和Hoffer用组织学方法发现，在输出小管结扎后使用睾酮治疗，起始段的细胞形态没有恢复正常。而Nicander认为由于起始段细胞频繁的有丝分裂依赖于来自睾丸管腔液的有丝分裂原。

雄激素结合蛋白（androgen binding protein，ABP）是第一个被提出的作用于附睾的睾丸非类固醇分子，能增强上皮主细胞功能并在附睾头的蛋白合成中发挥作用。γ-谷氨酰转肽酶mRNAⅣ（GGTⅣ）也在附睾起始段中受到管腔液因子的调控，但ABP没有在它的表达中发挥作用。相反，成纤维细胞生长因子（FGFs）可能部分调控GGTIV的表达。有假说认为FGFs与起始段顶细胞表面同源受体相互作用，启动了信号转导通路，例如MAPK，PI3K；而磷酸化作用启动了靶基因的转录使转录因子被激活。在睾丸管腔液中鉴定到的FGFs和起始段主细胞上鉴定到的FGFR-1Ⅲc支持了这一假说。另外，在缺乏睾丸因子的状态下，MAPK通路的活性和PEA3（ETV4）转录因子家族的表达下调，进而导致起始段细胞、凋亡。从这个研究中可以看出，在正常生理状态下，管腔液因子通过维持ERK通路的活性，抑制与压力有关的信号通路和细胞凋亡磷酸酶、细胞周期抑制剂，维持起始段细胞的存活。而起始段细胞内的雄激素受体对于正常的起始段功能也是至关重要的。

另一个调节起始段功能的因子是精子本身。精子被认为是一种不常见的配体，许多位于附睾的分子都是已知能与精子相结合的。更有趣的是，睾丸精子的生长因子受体染色为阳性，这似乎表明，当生长因子刚进入起始段时从精子表面上游离出来，并开始具有激发附睾顶细胞表面同源受体的能力。

睾酮对细胞作用的限制因素还未明确，虽然雄激素受体和激动剂都发挥着重要作用，但是有证据表明，配体才是主要的限制因素。此外，睾酮可以被ABP运输到其他位点，在一些组织中直接作用于雄激素受体，但是在一些如大脑核团的组织中睾酮需要被转化成雌二醇，并通过雌激素受体间接作用；而在一些其他组织中，它被还原成5α-二氢睾酮（DHT），DHT具有比睾酮具有更强的雄激素受体结合作用。后者发生在许多雄激素依赖性的组织，如附睾，前列腺、精囊和皮肤，而睾酮转化为DHT的效率与组织中5α-还原酶的浓度相关。

此外，附睾中存在许多载脂家族蛋白，呈高度区域性分布，可以与一些小分子配体结合，参与许多生物过程如维生素A转运、前列腺素合成、免疫应答、细胞生长与代谢调控等。载脂蛋白包括载脂蛋白1（LCN1）、载脂蛋白2（LCN2）、附睾视黄酸结合蛋白（E-RABP）、载脂型前列腺素D合酶（L-PGDS），其基因在各物种间的保守性较高，也提示它们具有重要的功能。通过X线结晶学确定的载脂蛋白基本功能是结合小分子的疏水性配体。

载脂蛋白1属于一类亲脂分子，在其他亲脂分子清除后，LCN1可以作为上皮表面的保护因子。此外，LCN1可以与微生物的铁载体有高度亲和力，在铁限制条件下抑制相当有效的细菌和真菌的生长，是保护机体免受有害分子和微生物和真菌感染的防御系统的一部分。LCN2又称NGAL（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin），其配体是一种细菌产生的小分子铁螯合剂，它可与铁结合形成可溶性的螯合物，供细菌吸收。因此，LCN2可以抑制细菌对铁的吸收，从而抑制细菌生长，具有强效抗菌作用。LCN2在炎症刺激下表达，提示LCN2可能在附睾对细菌的固有免疫应答中发挥作用。小鼠中的LCN2通过内化作用向精子传递三价铁，并提高细胞内pH值和cAMP的累积从而增加精子活力。PGDS是一种具有双重功能的蛋白，具有催化PGD2合成和转运亲脂性物质的作用。这种双重功能可反映载脂蛋白的亚功能化，在PGDS基因失活后，机体主要表现为睡眠和对疼痛反应的失调，但雄性生殖道未见明显表型，提示载脂蛋白簇的冗余。然而，PGDS已被报道是人类精液中精子质量的生化标志物，与公牛的生育力相关。另一项研究发现虽然最低生育力的公羊和公牛中有着最低的PGDS含量，但未能发现统计学意义上的相关性，这表明，PGDS能够影响雄性的生育力，但是可被其他的载脂蛋白代偿。

视黄酸是为E-RABP内源性配体，E-RABP基因失活产生的表型与视黄酸受体α基因突变小鼠的表型相似，都是不育或生育力低下。附睾尾上皮经过鳞状上皮化生，精子渗漏到结缔组织，导致炎症反应，而视黄酸与其受体的相互作用对附睾尾的上皮的维护至关重要。

胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生蛋白（cystatin-related epididymal spermatogenic，CRES）属于胱蛋白酶抑制剂（cystatin）家族，但是它缺乏抑制半胱氨酸蛋白酶的共有位点。CRES的负突变鼠会使精子获能失败从而导致生育力下降，对它的精子加入双丁酰环磷腺苷和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤可以扭转缺陷。而Cornwall等人发现它在细胞间通讯、蛋白质间相互作用的中介、递送蛋白质到成熟精子以及清除管腔中的分泌蛋白中具有一定作用。

附睾上皮的分泌物直接参与了附睾管腔内精子成熟所需的微环境形成。而附睾基因则对附睾功能和附睾精子成熟起重要的调控作用。附睾基因表达是一个高度程序化过程，因而造成了一个不断变化的管腔微环境。精子在这微环境中也发生了一系列程序性改变，逐步成熟获得了运动能力和受精能力。完全搞清附睾特异基因表达和附睾精子成熟之间的关系还需要大量的艰苦工作。

附睾的基因表达有很多特点，这些特点主要是：

许多基因呈现高度的附睾特异性，主要在附睾表达，在其他组织不表达或表达很低，如SC-342、HE2、HE6、GPX5、B／C、EAPI、ESP13.2、CES、CE9和CE10等。这些基因的附睾特异性揭示它们在附睾的功能中起重要作用。

附睾基因表达的一个最显著的特征是基因表达呈现出高度的区域性；有不少基因仅在附睾头部表达，如B／C、HE2、EAPI、GPXS、CRES、SC-384和SC-513，而附睾头部已被证明是蛋白合成和分泌非常活跃的区域。虽然附睾精子成熟如精子运动能力和受精能力的发育主要表现在附睾体部，但从调节角度看附睾头部则起更重要的作用；当然也有一些附睾特异基因主要表达在附睾体部和附睾尾部，如HE4、HE1、HE5、O／E、SC-177和SC-461等。而另外一些基因则表达于附睾头-体-尾全长。这和附睾精子成熟变化是相一致的，正如前述的附睾精子成熟变化或可起始于头部，或体部，或尾部，或进行了全长。这再次说明附睾特异基因在附睾及附睾精子成熟中的重要调节作用。

附睾基因表达还表现出另一种复杂性即细胞特异性，许多蛋白及mRNA在附睾同一区域表现出交叉排列的表达特征，在有些主细胞有强烈的表达，而相邻的主细胞则表达量很低。这就反映了这些上皮细胞尽管形态相似，但可能履行了不同功能或处于不同的功能状态。

由于输出小管中基因表达呈现出高度的区域性，附睾是研究基因表达调控机制的理想器官。许多因子已经被证明参与了类固醇激素的基因表达。附睾近端的睾酮水平高于循环水平，间质细胞分泌睾酮后，睾酮与支持细胞分泌的雄激素结合蛋白相结合，睾酮-雄激素结合蛋白复合体随即被转运到附睾管腔液中并被主细胞吞噬。而主细胞5α-还原酶的活性很高，能迅速将睾酮转变成双氢睾酮。循环库中的雄激素也能够在芳香化酶的作用下形成雌激素。众所周知，雄激素和雌激素能够调节附睾基因的表达。阉割后对附睾会产生极大的影响，阉割后的睾酮补充治疗不能够完全恢复附睾功能。精子本身已被证明能够影响附睾生理和蛋白分泌，能与附睾上皮相互作用。有研究发现在牛的附睾头、附睾体和附睾尾的原代上皮细胞中加入精子培养，能够调节细胞增殖。

在过去的十年间，非编码小RNA和其在转录、RNA的稳定性以及翻译中的功能也受到关注，Micro RNA（miRNA）是一类约22个核苷酸长度的非编码RNA，可使互补基因发生沉默，并参与许多生物信号通路和病理。已有研究发现附睾中miRNA的减少与mRNA的数目存在负相关，说明其在雄激素依赖性基因的表达中发挥作用。miRNA在人、小鼠、兔子的物种间保守性极低，但是miR-888 miRNA簇在灵长类动物中高度保守，主要在附睾中表达，表明这些miRNA在附睾基因的表达中有重要作用。

附睾中的DNA甲基化只有少数研究，在新生7天的大鼠附睾，cyclin D1启动子的甲基化被发现与表达水平呈负相关，但是在第7天时，cyclin D1的表达水平在不同的附睾段也不相同，在附睾尾部最高。而在出生后发育过程中，cyclin D1的表达模式也会改变，这就导致了成人附睾区域特异的表达，而这也将是研究启动子甲基化的一个有趣的方式。

Leeanod在1988年观察到精子在附睾运行和贮存的过程中死亡和变性明显增加的病例，并提出了附睾死精子症和精子变性的病理假说。附睾性死精子症和精子变性是附睾生殖病理的重要表现，也很可能是死精子症的重要原因。应该认识到对于附睾性死精子症及精子变性的病理及治疗研究还很不充分，应予以加强。

附睾性死精子症和精子变性的主要特点包括：①从睾丸活检的光镜和电镜观察发现睾丸精子是存活的，精子的细胞结构完整，无任何坏死和变性的病理表现；②精子活动率甚低，一般低于10%，精子死亡率高，一般可超过40%～50%；③增加射精频率，即缩短精子在附睾中的运行和贮存时间，能较明显提高精子的活动率和存活率。

推测附睾性死精子症和精子变性的可能主要原因包括：①附睾的免疫功能是以血-附睾屏障和免疫屏障为特征的，正常情况下由生精小管的生精细胞和支持细胞形成血-附睾屏障；血-附睾屏障能有效阻止大分子（如精子抗原物质）漏出附睾腔外和阻止血清蛋白等漏入附睾腔内，以免发生自身免疫反应。当生殖系统有炎性感染或器官损伤（输精管结扎后），屏障遭到破坏，精子表面的特殊大分子物质与机体内的免疫系统相接触，就会发生精子抗原的自身免疫反应，引起抗精子自身抗体产生，体内产生一种免疫球蛋白抑制精子活力，而精子抗体与精子相互作用激活补体系统，在补体作用下，通过细胞毒性作用对精子细胞膜的通透性和完整性产生损伤，从而杀死精子。②附睾上皮变性，导致附睾上皮大量溶酶体释放至管腔。③附睾精子的死亡和变性，使精子胞质小滴和从顶体释放出来的溶酶体酶进一步损害还未变性和死亡的精子，促使其解体。④活性氧由白细胞和精子产生并释放，一方面，活性氧是精子运动、获能、超激活运动、顶体反应、精卵识别所必需的，对维系精子正常功能起到重要作用；另一方面，由于病理、辐射、感染等各方面因素影响，精液中活性氧含量又会异常升高；精子膜脂质由于富含不饱和脂肪酸，细胞内几乎没有细胞质，抗氧化条件较差，在高反应能力的活性氧作用下，精子可能损伤，导致精子膜过氧化、核DNA片段化、蛋白变性等严重后果，对精子的存活和功能发挥造成巨大威胁。

有文献表明，通过第一次射精后60分钟内进行第二次射精，可以改善具有附睾性死精子症男性的精子质量和存活力。在患有这种病症的男性中已经通过12小时间隔内频繁射精的方法来保证精子活力，强烈射精疗法的目的是减少到达附睾的“年轻”精子暴露于附睾不好环境的时间。对于死精子症患者，在短期约60分钟内第二次射精能产生与第一次射精相比质量更好的精液。在一项描述该方法的研究中，与基础精子数相比，在大多数情况下（70%）改善了第二次射精。其他人报道第二次精液中精子浓度没有统计学显著变化，但精子活力显著增加。

附睾的主要功能之一是为附睾的精子成熟和精子贮存创造一个适宜的体液环境，附睾精子沉浸在一个液态的附睾微环境中。附睾的体液环境是通过调节附睾的分泌功能及吸收功能来实现的。附睾分泌功能的缺陷和分泌障碍可导致在附睾管腔中形成一个脱水状态。附睾继续分泌高分子量糖蛋白但无正常液体分泌，使附睾管道阻塞，形成梗阻性无精子症，从而可导致男性不育。梗阻性无精子症是由于输精管道的梗阻使精子的运输发生障碍而产生的无精子症。梗阻性无精子症在男性不育中的发生率约为1%。在无精子症患者中，梗阻性原因所占的比例较多，为42.4%～48%。

附睾梗阻是梗阻性无精子症的最常见原因，在FSH低于正常值高限2倍的无精子症中占30%～67%。先天性附睾梗阻常伴有先天性双侧输精管缺失（CBAVD），这些病例中82%至少有1个囊性纤维病基因点突变，这种病常伴有附睾远端部分缺如和精囊发育不良。先天性附睾梗阻还包括杨氏综合征（Young综合征），梗阻的原因主要是近端的附睾管腔内纤维化所致。

有研究表明附睾的分泌功能是和附睾上皮氯离子通道密切相关。如果附睾上皮的氯离子通道及其调节发生障碍，就能导致附睾的分泌障碍，造成附睾管道内的脱水状态，引起黏稠性物质积聚，从而造成管道阻塞。

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）广泛表达于人体各种器官的上皮细胞中，包括气管，消化道和生殖道。编码CFTR的基因的突变引起囊性纤维化（CF），这是高加索人中最常见的致死性遗传疾病，每3500个新生儿中大约发生1例。CF患者在多器官中表现出系统性疾病，包括慢性肺部感染、炎症，胰腺功能不全和不育症，其中不育症的主要原因被认为是 CFTR突变导致的电解质转运不良。CF的一个标志是男性不育，事实上，97%～98%的男性CF患者由于先天性双侧输精管缺失（CBAVD）而不育，导致梗阻性无精子症。除了CBAVD，在非阻塞性无精子症，少精子症，弱精子症和畸形精子症中也发现 CFTR突变频率的增加。其临床表现多表现为进行性肺衰竭、胰腺功能不全及男性不育等。

CBAVD约占无精子症的15%～20%，近几年越来越多的研究显示该病与囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）有关，并被公认为是CF的一种临床亚型。国外报道CBAVD患者的 CFTR基因突变以ΔF508号外显子第1653～1655位三个碱基TTT缺失，导致第508位苯丙氨酸缺失最为常见，高达70%。国内对患者的基因突变情况研究较少，致病机制尚不明确。

CBAVD的发病机制可能与胚胎发育期 CFTR基因突变有关，使Müller管异常，中肾管停止发育或缺陷，导致输精管发育畸形与缺失，且常伴有精囊腺缺如或纤维化。对原代啮齿动物Sertoli细胞和生殖细胞以及来自 CFTR敲除小鼠或隐睾模型的睾丸的研究　结　果　表　明，CFTR通　过HCO ₃ ^-／sAC／cAMP ／CREB（CREM）途径参与精原细胞的NF-κB／COX-2／PGE ₂途径，实验还揭示了CFTR在精子获能中起到关键作用，直接或间接介导对于获能至关重要的HCO ₃ ^-进入。 CFTR在最新的研究中正在成为一个多功能的基因，介导各种生殖过程相关的不同信号通路，此外，其在电解质和流体转运中的作用是公认的，能调节雄性生殖道的管腔微环境。还有研究提示Y染色体的基因微缺失也与CBAVD有关，14例CBAVD的男性不育患者中发现2例存在AZFa位点的缺失。Daudin等报道CBAVD中24.5%的患者无突变，Mecallum等推测这些CBAVD患者的形成是由于在其胚胎发育早期（7周前）有一个非 CFTR基因的突变，它导致整个中肾管异常发育从而形成CBAVD。另外在一些家系中父子同胞携带同一突变时仅其中之一患CBAVD，这说明在发生过程中除 CFTR基因异常外，还可能存在其他遗传因素或环境因素的作用。各种因素如干扰中肾管的正常发育或退化，可导致绊状畸形发生。

对囊性纤维化无精子症患者不能精道重建，所以他们要生育唯一可选择的是辅助生殖技术，即采用显微外科技术从附睾（MESA）或直接从睾丸实质（TESE）获取精子用于随后的卵胞质内单精子注射（ICSI）。不推荐传统的IVF，因为其受孕率太低。

1970年，利物浦泌尿科医师大卫·扬（David Young）观察到54%的患者有梗阻性无精子症并伴随有肺部缺陷，认为无精子症与肺部之间有关联，称作Berry-Perkins-Young综合征，简称为杨氏综合征。杨氏综合征是一种罕见的疾病，包括三种表现：梗阻性无精子症，支气管扩张和鼻窦炎，是一个公认的会造成男性不育的疾病。据报道杨氏综合征在男子不育症中占3.5%，在男子阻塞性不育症中约占21%～67%，多数报道约占50%。最近欧洲和美国的几个案例报告认为减少汞的使用可能使发病率下降，童年时期汞接触过多可能是病因之一。在杨氏综合征的相关统计中，汞中毒（粉红病）的概率在10%左右。汞能抑制含巯基的酶，与硫醇反应形成硫醇盐，而硫醇盐被认为能抑制糖酵解，阻碍机体必要的正常功能和获取能量供应精子和纤毛。

杨氏综合征的主要特点在于附睾上皮分泌液逐步减少，黏度增加，内容物黏厚，从而一步步导致附睾通道的梗阻，造成阻塞性无精子症。因此杨氏综合征导致的无精子症是渐进性的，可由完全畅通到不完全性阻塞直至完全性阻塞，表现在精子数量上从开始正常到减少直至精液中缺乏精子。在附睾渐进性梗阻过程中附睾的功能性指标也会发生相应的变化。此外，常伴有呼吸道感染。而呼吸道感染也可能是由于呼吸道黏液分泌异常，引起黏液浓缩的呼吸道清除功能下降，最终导致呼吸道感染。事实上由于此病发病机制尚不清楚及缺少相关的发病率资料，因此，尚不能确定是否杨氏综合征本身代表一个病种。目前对杨氏综合征还无良好的治疗方法。尝试外科学方法解除精道梗阻没有或仅有暂时效果。因此，采用显微外科技术从附睾（MESA）或直接从睾丸实质（TESE）获取精子用于卵胞质内单精子注射（ICSI），是希望生育的患者可选择的治疗方法。用附睾输精管吻合法虽能解决附睾的通道，但不能解决附睾的精子成熟。也可应用某些药物降低附睾分泌的黏稠性，关键问题应该解决附睾上皮氯离子通道及其调节，这样才能从根本上解决附睾阻塞性无精子症。

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