第五节 蛋白质芯片技术
一、概述
（一）蛋白质芯片技术的概念与基本原理
人类基因组计划已进入后基因组时代（post genome era）、功能基因组时代，而蛋白质作为基因功能的直接体现者，其之间的相互作用越来越受到关注。因为要彻底了解生命的本质，就必须要了解蛋白质在生物生长、发育、衰老整个生命过程中的功能，以及不同蛋白质之间相互作用及其发生、发展和转化规律，从而诞生了一门新的学科——蛋白质组学。蛋白质芯片技术是继基因芯片之后发展起来的生物检验技术，其高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点成为研究蛋白质组学的有力工具，对生物学、免疫学、临床检验医学、遗传学、药理学等众多学科的进步具有重大意义。
将各种蛋白质有序固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用芯片，用标记了特定荧光抗生素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分去除，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点荧光强度，分析蛋白质与蛋白质之间相互作用关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。为了实现这一目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适载体上，同时能够维持蛋白质的天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物活性。另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能复杂性，开发和建立具有多样品并行处理能力、进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。
（二）蛋白质芯片技术的分类
1.根据蛋白质芯片功能
可分为功能研究型芯片、检测型芯片。功能研究型芯片多为高密度芯片，载体上固定的是天然蛋白质或融合蛋白，主要用于蛋白质活性以及蛋白质组学相关研究。检测型芯片密度相对较低，载体上固定的是抗原、抗体等，主要用于生物分子的大量、快速检测。
2.根据芯片表面的不同化学成分
可分为化学表面芯片、生物表面芯片。化学表面芯片分为疏水、亲水、阳离子、阴离子、金属螯合芯片，用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱。生物表面芯片分为抗体、抗原、受体-配体、DNA-蛋白质芯片等。
3.根据点样蛋白质有无活性功能
可分为无活性芯片、有活性芯片。无活性芯片是将已合成的蛋白质点在芯片上，其制作方式主要分为原位合成、点合成、光蚀刻术等。有活性芯片是指点在芯片上的样品是活的生物体（例如：细菌等），在芯片上原位表达蛋白质。相对于无活性芯片，有活性芯片可以提供机体模拟内环境，对于蛋白质功能分析更为有利。
4.根据载体不同
可分为普通玻璃载体芯片、多孔凝胶覆盖芯片、微孔芯片等。
（三）蛋白质芯片技术的优点
①对生物样品要求较低，可简化样品的前处理，只需对少量标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测，甚至可以直接利用各种生物材料（血样、尿液、细胞及组织等）进行分析，便于诊断、实用性强。
②可快速、高通量、定量分析大批蛋白样品。
③蛋白芯片使用相对简单，全自动化操作，结果正确率较高。
④不同于传统酶标ELISA分析，蛋白质芯片采用光敏染料标记，灵敏度更高、准确性更强。
⑤蛋白芯片所需试剂和样品较少，产品化后价格更低廉。
二、蛋白质芯片的关键技术
（一）探针蛋白的制备
可根据研究目的不同，选用抗体、抗原、受体、酶等生物活性蛋白作为探针蛋白。由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的探针蛋白，用其构筑的芯片可用于检测蛋白质表达丰度及确定新蛋白质。也可利用其他蛋白质文库制备探针蛋白，例如：全合成人重组抗体库、噬菌体肽库、噬菌体表达文库等。
（二）芯片的制备
蛋白质比DNA难合成，更难以在固相支持物表面合成，因此蛋白质芯片比DNA芯片复杂得多，芯片制作过程中保持蛋白质的生物活性成为一大难题。Ciphergen Biosystems公司是世界上较早发展蛋白质芯片的公司，可制备化学型、生物化学型两种蛋白质芯片，但目前该公司所生产和推广的蛋白质芯片大多数还局限在化学型芯片上。
1.化学型蛋白质芯片
经典色谱（反相色谱、离子交换色谱、金属螯合色谱等）的介质分为疏水、亲水、阳离子、阴离子、金属螯合芯片等五种。铺有相关介质的蛋白质芯片可通过介质的疏水力、静电力、共价键等结合样品中的蛋白质，然后经特定洗脱液去除杂质蛋白，保留目的蛋白质。此种芯片特异性较差。
2.生物化学型蛋白质芯片
将生物活性分子（抗体、受体、配体等）结合至芯片表面，用于捕获样品中的靶蛋白。由于生物化学型蛋白质芯片具有高度的特异性及生物活性分子的多样性，其应用范围和应用前景都明显优于化学型蛋白质芯片。
Uetz等使用酵母双杂交系统构筑蛋白质芯片；Arenkov等曾将探针蛋白固定于聚丙烯酰胺凝胶中，待测样品通过电泳与凝胶中的探针蛋白发生特异性结合，从而捕获兴趣靶蛋白；Macbeath等根据DNA微陈列原理设计出蛋白质微阵列。
（三）蛋白质芯片的检测
目前，对吸附到蛋白质芯片表面的靶蛋白检测主要有两种方式。
1.以质谱技术为基础的直接检测法
Ciphergen Biosystems公司采用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS），使用激光解吸电离法将保留在芯片上的蛋白质解离出来。芯片经室温干燥后，添加能量吸附因子（energy absorb molecule，EMA）例如芥子酸，使其与蛋白质结合形成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解吸和离子化，利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解吸形成荷电离子；再根据不同质荷比离子在仪器场中飞行的时间长短不一，通过飞行时间质谱来精确测定蛋白质质量，并由此绘制质谱图，以分析蛋白质的分子量和相对含量。
2.蛋白质标记法
样品中的蛋白质预先用荧光物质或同位素等标记，结合到芯片上的蛋白质就会发出特定信号，再采用CCD（charge-coupled device）照相技术及激光扫描系统等对信号进行检测。从定量及简便角度来讲，该方法优于前述以质谱技术为基础的直接检测法。与DNA芯片相同，蛋白质芯片同样蕴含着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件包进行图像分析、结果定量和分析解读。
三、蛋白质芯片技术的应用
蛋白质芯片技术的研究对象是蛋白质，而在机体内执行大量生物功能的正是蛋白质，因此蛋白质芯片有其独特的优势价值和应用前景。
（一）基因表达筛选
Angelikal等人从人胎儿大脑的cDNA文库中选出92个克隆的粗提物制成蛋白质芯片，用特异性抗体对其进行检测，结果准确率在87%以上，而用传统的原位滤膜技术准确率只达到63%。与原位滤膜相比，用蛋白质芯片技术在同样面积上可容纳更多的克隆，灵敏度可达到皮克级，大大减少了实验次数、提高了实验灵敏度。
（二）特异性抗原抗体检测
蛋白质芯片上的抗原抗体反应体现出强特异性，在一块蛋白质芯片上的10800个点中，根据抗原抗体特异性结合可检测到唯一的1个阳性位点。这种特异性抗原抗体反应一旦确立，就可以利用这项技术来度量整个细胞或组织中蛋白质的丰富程度和修饰程度。同时，利用蛋白质芯片技术，根据与某一蛋白质多种组分亲和的特征，可以筛选某抗原的未知抗体，从而将常规免疫分析微缩到芯片上进行，使免疫检测更加方便、快捷、高效。
（三）蛋白质筛选及功能研究
常规筛选蛋白质主要是在基因水平进行，基因水平筛选虽已被运用到任意DNA文库，但多以噬菌体为载体，通过噬菌斑转印技术（plaque lift procedure）膜上表达蛋白质。此方法虽有效，但由于许多蛋白质不是全长基因编码，且真核基因在细菌中往往不能产生正确折叠的蛋白质、噬菌斑转移不能缩小到毫米范围进行，往往具有很大的局限性，而蛋白质芯片恰好可弥补此不足。另外，还可根据同源蛋白质上的特异残基，用蛋白质芯片区分同源蛋白质。
（四）新药研制开发
许多新药往往进入临床试验阶段才发现具有明显不良反应而无法继续研发，这对前期的研究工作造成极大浪费。利用蛋白质芯片在药物研制初期就可检验该药物是否只与某一蛋白质结合、不与其他蛋白质结合，从而预判并推断该药可能的不良反应，便于及早发现并解决问题。
（五）疾病研究
使用蛋白质芯片可绘制正常人和各种疾病患者体内的蛋白质图谱，通过比较可查找疾病中特异表达的蛋白质，再将这些特异表达蛋白质制成芯片，为肿瘤、遗传性疾病、传染性疾病等的诊断提供依据，还可以给引起疾病的不同种类蛋白质进行组织定位，有助于寻找疾病发生的根源，为疾病的治疗提供线索。
以肿瘤研究为例，首先从抗体库中挑选有潜在诊断意义的抗体，点布在片基上制备抗体芯片，高滴度的抗体库是这一研究的关键。从正常及肿瘤组织中分离提取蛋白质，分别与抗体芯片反应，实验结果通过计算机进行比对，检测分析正常组织和肿瘤之间蛋白质表达的差异，为深入探究肿瘤的发生、发展以及诊断、治疗提供了新途径，对样品的高通量筛选亦极有利于肿瘤的初筛性普查及预测。
（六）生化反应中酶的检测
参与人体生理代谢的酶类繁多，对酶活性的测定一直是临床生化检验中的重要组成部分。酶作为一种特殊蛋白质，可以用蛋白质芯片技术研究其底物、活性以及激活剂、抑制剂等，某些酶活性的改变是疾病诊断中不可缺少的指标，而其激活剂、抑制剂则是研究某些疾病发生、发展以及防治的重要手段。
以对ATP上磷酸基团转移起重要作用的蛋白激酶A为例，可用常规光蚀刻技术制备芯片，再将酶及底物加至芯片小室，在电渗作用中使酶及底物经通道接触发生酶促反应。通过电泳分离，可得到荧光标记的多肽底物及产物的变化，以此来定量酶促反应结果。在此基础上，还可加入特异的抑制物和/或激活剂，进一步研究对酶促反应的特异性抑制及激活作用。