陈钧辉《普通生物化学》(第5版)配套题库【名校考研真题+课后习题+章节题库+模拟试题】
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第3章 蛋白质化学

一、选择题

1有一混合蛋白质溶液,各种蛋白质的pI分别为4.6;5.0;5.3;6.7;7.3。电泳时欲使其中4种泳向正极,缓冲液的pH应该是(  )。[中国科学院2007研]

A.5.0

B.4.0

C.6.0

D.7.0

E.8.0

【答案】D

【解析】氨基酸的带电状况与溶液的pH有关,改变pH可以使氨基酸带上正电荷或负电荷,也可以使它处于正负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态。使氨基酸处于净电荷为零时的pH,称为等电点,记为pI。一般来说,当pH>pI时,多肽链带净负电荷,在电场中将向阳极移动,在低于等电点的任一pH,多肽链带有净正电荷,在电场中将向阴极移动。本题欲使其中4种蛋白质泳向正极,即有4种蛋白质应带上净负电荷,即pH应大于前4个蛋白的pI,且小于第五个蛋白的pI,因此答案选D。

2下列哪组反应是错误的?(  )[河北师范大学2001研]

A.Arg-坂口反应

B.多肽-双缩脲反应

C.氨基酸-茚三酮反应

D.Trp-乙醛酸反应

E.Phe-偶氮反应

【答案】E

【解析】苯丙氨酸没有特殊的颜色反应,偶氮反应是酪氨酸所特有的颜色反应。

3下列氨基酸中,哪一种含氮量最高?(  )[河北师范大学2002研]

A.Arg

B.His

C.Gln

D.Lys

E.Pro

【答案】A

【解析】所有的氨基酸都含有N元素,而精氨基酸分子中的N元素有四个,所以它的含量是所有氨基酸中最高的。

4下列有关蛋白质的叙述哪项是正确的?(  )[西南农业大学2002研]

A.蛋白质分子的净电荷为零时的pH是它的等电点

B.通常蛋白质的溶解度在等电点时最大

C.大多数蛋白质在饱和硫酸铵中溶解度增大

D.由于蛋白质在等电点时溶解度大,所以一般沉淀蛋白质时应远离等电点

E.以上各项全不正确

【答案】A

【解析】蛋白质等电点是指蛋白质分子内的正电荷总数与负电荷总数相等时的pH。因此,在等电点时,蛋白质分子的净电荷等于零,即处于等电点的蛋白质分子在电场中既不向正极移动,也不向负极移动。由于在等电点时蛋白质分子间的静电斥力最小,所以其溶解度最小,在溶液中易于沉淀。饱和硫酸铵常用于沉淀蛋白质,因为大量的中性盐离子夺走蛋白质周围的水化层,并抑制其解离,因而导致蛋白质易于沉淀,溶解度最小。

5有一肽,用胰蛋白酶水解得:H-Met-Glu-Leu-lys-OH;H-Ser-Ala-Arg-OH;H-Gly-Tyr-OH三组片段。用BrCN处理得H-Ser-Ala-Arg-Met-OH;H-Glu-Leu-lys-Gly-Tyr-OH两组片段。按肽谱重叠法推导出该九肽的序列应为(  )。[中国药科大学2005研]

A.

B.

C.

D.

E.

【答案】B

【解析】(1)一般来说,如果多肽链只断裂成两段或三段便能测出其氨基酸序列,只要知道原多肽链的C端和N端的氨基酸残基就可以推断出它们在原多肽链中的前后次序。但是多数情况下,除了能确定C端肽段和N端肽段的位置外,中间那些肽段的次序是不能确定的。若借助两种或两种以上的不同方法断裂多肽样品,使成具有重叠肽的几套肽段,这样依靠重叠肽就可以确定肽段在原多肽链中的正确位置,拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。这种方法即为肽谱重叠法。(2)胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶,专一性强,只断裂赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)残基的羧基参与形成的肽键。用它断裂得到的是以Arg或Lys为C-末端残基的肽段。题中两组片段即分别为Arg或Lys为C-末端残基的肽段。溴化氢(BrCN)只断裂由甲硫氨酸(Met)残基的羧基参与形成的肽键。题中第组即为以Met为C-末端残基的肽段。从两种处理方式获得的水解产物可以看出,该肽只有一个Met残基,各组片段之间有相互重叠的肽段,如下:

H-Met-Glu-Leu-lys-OH;

H-Ser-Ala-Arg-OH;

H-Gly-Tyr-OH;

H-Ser-Ala-Arg-Met-OH;

H-Glu-Leu-lys-Gly-Tyr-OH。

借助上述重叠肽,可以推测该肽的氨基酸序列应为:

Set-Ala-Arg-Met-Glu-Leu-lys-Gly-Tyr

6具有四级结构的蛋白质特征是(  )。[华东理工大学2007研]

A.分子中必定含有辅基

B.在两条或两条以上具有三级结构多肽链的基础上,肽链进一步折叠、盘曲形成

C.每条多肽链都具有独立的生物学活性

D.依赖肽键维系四级结构的稳定性

E.由两条或两条以上具有三级结构的多肽链组成

【答案】E

【解析】蛋白质的四级结构是指两条以上具有三级结构的多肽链之间缔合在一起的结构。其中,每条具有三级结构的多肽链称为亚基,一般具有四级结构的蛋白质才有生物学活性。维持其稳定的是次级键,如氢键、盐键、疏水键、范德华力等。

7蛋白质中氨基酸在280nm处光吸收值最大的是(  )。[厦门大学2014研]

A.色氨酸

B.酪氨酸

C.苯丙氨酸

D.赖氨酸

【答案】A

8组成蛋白质的单位是(  )。[武汉大学2014研]

A.L-α-氨基酸

B.D-氨基酸

C.L-β-氨基酸

D.D-酸-氨基酸

E.L-D-氨基酸

【答案】A

【解析】氨基酸是组成蛋白质的基本单位,存在于自然界的氨基酸有300多种,但组成人体蛋白质的仅有20种氨基酸,都是L-基酸氨基酸(甘氨酸除外)。

9下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时,最先被洗脱的是(  )。[武汉大学2014研]

A.牛胰岛素(分子量5700)

B.肌红蛋白(分子量16900)

C.牛β乳球蛋白(分子量35000)

D.血清清蛋白(分子量68500)

E.马肝过氧化物酶(分子量247500)

【答案】E

【解析】凝胶过滤层析的基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按分子大小分开,达到分离的目的。小分子物质能进入凝胶颗粒内部,流下时路程较长,而大分子物质却被排除在外部,下来的路程短,因此大分子物质先洗脱出来,而小分子物质后被洗脱出来。

10下列哪种氨基酸溶于水时不引起偏振光旋转?(  )[武汉大学2014研]

A.谷氨酸

B.亮氨酸

C.丙氨酸

D.甘氨酸

E.苯丙氨酸

【答案】D

【解析】甘氨酸没有手性碳原子,因此不具有旋光性,其溶于水也不存在变旋现象,因此也不能使偏振光旋转。

11在蛋白质一级结构测定时要确定二硫键的位置,可以用下列哪一种方法测定出含二硫键的肽段?(  )[华中农业大学2016研]

A.巯基化合物还原

B.过甲酸氧化

C.对角线电泳

D.双向电泳

【答案】C

【解析】对角线电泳是把水解后的混合肽段点到滤纸的中央,在pH6.5的条件下,进行第一向电泳,肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中,使-S-S-断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽。滤纸旋转90°角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里,大多数肽段的迁移率未变,并将位于滤纸的一条对角线上,而含半胱氨磺酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加,结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含半胱氨磺酸的肽段(未用茚三酮显色的)分别取下,进行氨基酸顺序分析,然后与多肽链的氨基酸顺序比较,即可推断出二硫键在肽链间或(和)肽链内的位置。

二、填空题

1尿素是一种蛋白质的变性剂,其主要作用是______。[复旦大学1999研]

【答案】破坏蛋白质的二级结构

【解析】引起蛋白质变性的试剂有很多,但其作用方式并不完全一致,如尿素和胍能与多肽主链竞争氢键,更重要的原因是能增加非极性侧链在水中的溶解度,因而降低了维持蛋白质三级结构的疏水相互作用。而SDS则是破坏蛋白质分子内的疏水相互作用使非极性基团暴露于介质水中。

2Edman降解是从多肽链游离的______末端测定氨基酸残基序列的过程。[中山大学2018研]

【答案】N

3在蛋白质的二级结构中,只要存在______α-螺旋结构就会被中断。[华南师范大学2004研]

【答案】脯氨酸(或羟脯氨酸)

【解析】一条肽链能否形成α-螺旋,以及形成的螺旋是否稳定,与它的氨基酸组成和序列有极大的关系。一般而言,R基越小,电荷越少,越利于α-螺旋的形成和稳定。多聚脯氨酸的α-碳原子参与R基吡咯的形成,环内的Cα-N键和C-N肽键都不能旋转,而且多聚脯氨酸的肽键不具酰胺氢,不能形成链内氢键。因此,多肽链中只要存在脯氨酸(或羟脯氨酸),α-螺旋即被中断,并产生一个“结节”。

4维持蛋白质系水胶体稳定的因素是____________[西南农业大学2001研]

【答案】水化层;双电层

5测定蛋白质浓度的方法有______、______和______等。[华中农业大学2017研]

【答案】凯氏定氮法,紫外分光光度法,双缩脲法

【解析】测定蛋白质浓度的方法,即一定体积下的蛋白质定量方法,常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、紫外吸收法和考马斯亮蓝染色法等。

6蛋白质分子中氮的平均含量为______,故样品中的蛋白质含量常以测氮量乘以______,即______[四川大学2000研]

【答案】16%;6.25;16%的倒数

7生物体内大多数蛋白质形成正确构象时需要______的帮助,某些蛋白质的折叠还需要____________酶的催化。[华中农业大学2008研]

【答案】分子伴侣;蛋白质二硫键异构酶;肽基脯氨酸异构酶

8常用的肽链N端分析的方法有______法、______法、______法和______法。[华中师范大学2008研]

【答案】DNS;Sanger;Edman降解;氨肽酶

9增加溶液的离子强度能使某种蛋白质的溶解度增高的现象称为______,在高离子强度下使某种蛋白质沉淀的现象称为______[武汉大学2007研]

【答案】盐溶;盐析

三、判断题

1蛋白质分子的亚基与结构域是同义词。(  )[西南农业大学2000研]

【答案】

【解析】亚基是指一条多肽链或以共价键连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位。而结构域是指在较大的球状蛋白质分子中,多肽链往往形成几个紧密的球状构象,彼此分开,以松散的肽链相连,此球状构象就是结构域。

2参与蛋白质组成的氨基酸中Trp、Tyr和Phe在紫外区有光吸收,这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。(  )[中山大学2018研]

【答案】

3色氨酸是含有两个羧基的氨基酸。(  )[中山大学2018研]

【答案】

【解析】色氨酸是杂环氨基酸,不含有两个羧基;常见的20种蛋白质氨基酸中含有两个羧基的氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸。

4蛋白质的亚基(或称亚单位)和肽链是同义的。(  )[中国科学技术大学1999研]

【答案】

【解析】亚基是肽链,但肽链不一定是亚基。如胰岛素A链与B链,经共价的硫-硫键连接成胰岛素分子,A链与B链不是亚基。

5四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件。(  )[中山大学2018研]

【答案】

【解析】具有三级结构的单体蛋白质就具有生物学活性,而组成蛋白质四级结构的亚基同样具有三级结构,当其单独存在时不具有生物学活性,因此四级结构不是蛋白质保持生物学活性的必要条件。

6某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸,它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经修饰衍生而来的。(  )[中山大学2018研]

【答案】

【解析】某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸,它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来的,如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸。

7蛋白质中的稀有氨基酸是翻译后修饰而成的。(  )[浙江大学2018研]

【答案】

【解析】硒代半胱氨酸不属于题目中说的稀有氨基酸,稀有氨基酸指的是羟脯氨酸和羟赖氨酸等氨基酸。

8只有在pH很高或很低时,氨基酸才主要以非离子化形式存在。(  )[山东大学2016研]

【答案】

【解析】在水溶液中氨基酸癿非离子化形式从来不会占优势。

9变性蛋白质溶解度降低是由蛋白质分子的电荷被中和去除了蛋白质外面的水化层所引起的。(  )[山东大学2016研]

【答案】

【解析】蛋白质变性是由于维持蛋白质构象稳定的作用力(次级键和二硫键)被破坏从而使蛋白质空间结构被破坏并使个体丧失生物活性的现象,次级键破坏之后,蛋白质结构松散,原来聚集在分子内部的疏水性氨基酸侧链伸向外部,减弱了蛋白质分子与水分子之间的相互作用,因此溶解度降低。

10蛋白质变性后,会使大量氨基酸游离出来。(  )[山东大学2016研]

【答案】

【解析】蛋白质变性是指蛋白质的空间结构被破坏,而一级结构仍保持完整,所以不会有氨基酸游离出来,大量氨基酸游离出来的现象称为氨基酸的降解。

11丝氨酸是蛋白质的磷酸化位点,因此蛋白质中含有的丝氨酸残基均能被磷酸化。(  )[华中农业大学2016研]

【答案】

12蛋白质分子由α-蛋氨基酸组成,这些氨基酸α-碳是一个手性碳原子,因此均具有光学活性。(  )[中山大学2018研]

【答案】

【解析】常见的20种蛋白质氨基酸中除Pro是α-亚氨基酸外,其余的都是由α-氨基酸组成,除Gly外其余氨基酸都具有一个手性碳原子,因此均具有光学活性。

13疏水蛋白质的折叠伴随着多肽链的熵增加。(  )[清华大学研]

【答案】

【解析】蛋白质折叠过程是有序化的过程,故熵减少。

14蛋白质变性和DNA变性的机理是相似的,复性时都可以恢复原来的生物活性。(  )[天津商学院研]

【答案】

【解析】蛋白质变性根据变性程度可以分为可逆变性和不可逆变性,原来的生物学活性不一定能够恢复;DNA变性后一般可以恢复原来的生物学活性。

四、名词解释题

1凝胶过滤层析。[华中科技大学2017研]

答:凝胶过滤层析又称为排阻层析或分子筛法,是指根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质的质量进行分离和纯化的一种方法。这种方法比较简便,不要求复杂的仪器就能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来,小分子后流出来。

2盐析作用[山东大学2016研]

答:盐析作用是指在蛋白质水溶液中加入中性盐,随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象;中性盐是强电解质,溶解度又大,在蛋白质溶液中,一方面与蛋白质争夺水分子,破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜;另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷,从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。常用的中性盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等,但硫酸铵最常用。

3超二级结构[山东大学2016研]

答:超二级结构是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构(主要是α-螺旋和β-折叠)常常在空间折叠中靠近,彼此相互作用,形成规则的二级结构聚集体,在多种蛋白质中充当三级结构的构件。

4亲和层析[山东大学2016研]

答:亲和层析是指在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合,如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合,这种结合既是特异的,又是可逆的,改变条件可以使这种结合解除的层析技术。

5必需氨基酸[山东大学2016研]

答:必需氨基酸是指人体(或其他脊椎动物)必不可少,而机体内又不能合成的,必须从食物中补充的氨基酸;对成人来说,这类氨基酸有8种,包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,对婴儿来说,组氨酸也是必需氨基酸。

6结构域[山东大学2017研]

答:结构域是指在较大的球状蛋白质分子中,多肽链彼此分开并以松散的肽链相连而形成的球状构象。酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间,因为结构域有利于活性中心与底物的结合。

7分子伴侣[华中农业大学2017研]

答:分子伴侣是指在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装,而在组装完毕后与之分离,不构成这些蛋白质结构执行功能组分的蛋白质,是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质。

8锌指结构[浙江大学2018研]

答:锌指结构是指许多转录因子所共有的DNA结合结构域,具有很强的保守性。在DNA结构域中含有较多的半胱氨酸和组氨酸的区域,借助肽链的弯曲使2个Cys和2个His与一个锌离子,或者4个Cys与一个锌离子络合成的一个形似指状的三级结构。

9Electrophoresis[武汉大学2015研]

答:Electrophoresis的中文名称是电泳,又称离子泳,是指在外电场的存在下,利用分子携带的净电荷不同以分离混合物的一种实验技术。其原理是根据相对分子质量的差异来分离混合物的,相对分子质量越大,在电泳中移动速度就越慢,移动距离越短,条带离电泳孔越近,反之,相对分子质量越小,条带离电泳孔越远。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等生物分子的分析分离和制备。

10谷胱甘肽[武汉大学2014研]

答:谷胱甘肽是指由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的三肽物质,可作为体内重要的还原剂,保护蛋白质和酶分子中的疏基免遭氧化,使蛋白质或酶处在活性状态。

11pI[武汉大学2014研]

答:pI即等电点,是指使蛋白质或氨基酸在溶液中解离成正、负离子的趋势相等,即成为兼性离子,净电荷为零时的溶液pH。

12肽单位[华中师范大学2009研]

答:肽单位,又称为肽键,是肽链主链上的重复结构,由参与肽键形成的氮原子、碳原子和它们的4个取代成分(羰基氧原子、酰胺氢原子和两个相邻α-碳原子)组成的一个平面单位。

13蛋白质变性作用[华中师范大学2008研]

答:蛋白质的变性作用是指天然蛋白质因受物理因素或化学因素影响,其分子内部原有的高度规律性结构发生变化,致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变,但并不导致蛋白质一级结构的破坏的现象。

14别构调节[厦门大学2007研]

答:别构调节是指别构调节酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变,进而改变酶活性状态的现象。

15protein tertiary structure[华中农业大学2008研]

答:protein tertiary structure即蛋白质三级结构,是指多肽链中所有原子和基团的构象,它是在二级结构的基础上进一步盘曲折叠形成的,包括所有主链和侧链的结构。

16quaternary structure of protein[中南民族大学2009研]

答:quaternary structure of protein即蛋白质的四级结构,是组成寡聚蛋白亚基的种类、数目、各种亚基在寡聚蛋白中的空间排布,以及亚基之间的相互作用。

17外肽酶[武汉大学2014研]

答:外肽酶又称肽链端解酶,或端解酶,是蛋白水解酶一类,可催化多肽链末端肽键水解,游离末端氨基酸。根据其所剪切肽链末端为氨基端或羧基端又可分为氨基肽酶和羧基肽酶;此外,还包括催化二肽水解的二肽酶,从多肽链末端剪切二肽的二肽基肽酶。

18内肽酶[武汉大学2015研]

答:内肽酶又称蛋白酶,是指主要作用于蛋白质多肽链内部的肽键从而使蛋白质长链分解成短肽片段的蛋白质酶类。蛋白酶水解蛋白质时,作用部位因肽键种类而异,如胰蛋白酶的切点的羧基侧为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)肽键;胃蛋白酶的切点两端为芳香族氨基酸;枯草杆菌碱性蛋白酶的切点的羧基侧为疏水性芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)等,这种蛋白酶对切点的特异性要求称为蛋白酶的底物专一性,利用蛋白酶的底物专一性可以定向获得特殊结构的多肽。

五、问答题

1测定氨基酸的氨基态氮,使用NaOH标准溶液测定氨基酸的羧基,再直接求出氨基态氮的量。试问在NaOH滴定前为什么要加甲醛?[上海师范大学研]

答:氨基酸分子在溶液中主要以两性离子形式存在,因其毗邻的羧基与氨基间相互影响而导致等当点pH过高(12~13)或过低(1~2),没有适当的指示剂选用,因此不能直接采用酸、碱滴定法准确定量。通常可通过在溶液中加入中性甲醛以降低其氨基的碱性,即生成-NH(CH2OH)和-N(CH2OH)2之类的羟甲基衍生物而不形成两性离子,相对增强了-NH3的酸性解离,使其氨基等电点减少2~3而移至pH9左右以达到酚酞类指示剂的显示范围。

2什么是蛋白质的变性作用?举例说明实际工作中应用和避免蛋白质变性的例子。[武汉大学2015研]

答:(1)蛋白质的变性作用是指天然蛋白质分子由于受到理化因素的影响使次级键断裂,引起天然构象的改变,导致其生物活性的丧失及一些理化性质,如紫外吸收光谱等的改变,但并未引起肽键的断裂的现象。有些变性蛋白质在除去引起变性的理化因素后,又可以复性。

(2)实际工作中应用和避免蛋白质变性的例子

工作中应用蛋白质变性的例子

如用乙醇加热和紫外线消毒灭菌,用热凝固法检查尿蛋白等。

工作中避免蛋白质变性的例子

如制备或保存酶、疫苗、免疫血清等蛋白质制剂时,应选择适合条件,防止其变性失活。

32,3-二磷酸甘油酸(BPG)是如何调节血红蛋白运氧功能的?[华中农业大学2017研]

答:2,3-二磷酸甘油酸(BPG)是血红蛋白的一个重要的别构效应物。在BPG存在下,血红蛋白的氧合作用可用下面的方程式表示:

HbBPG+4O2→HbBP(O24+BPG

红细胞中的2,3-DPG与脱氧血红蛋白结合,使脱氧血红蛋白的空间构象稳定,从而降低血红蛋白对O2的亲合力,促使O2和血红蛋白解离。尤其当血液通过组织时,红细胞中2,3-DPG的存在就能显著促进O2的释放以供组织需要。

4什么是蛋白质变性?哪些环境因素可以造成蛋白质变性?[浙江大学2017研]

答:(1)蛋白质变性是指蛋白质在某些强烈的物理和化学因素作用下,其特定的空间构象被改变,但一级结构保持完整,从而导致其理化性质改变和生物活性丧失的现象。

(2)蛋白质变性的环境因素

化学因素

强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮、去污剂等。

物理因素

高温、紫外线或X光照射、超声波、剧烈震荡或搅拌等。

5蛋白质的分离纯化可以利用蛋白质溶解度的差异。下列每对多肽中哪个多肽在对应的pH条件下在水溶液中的溶解度最大?[山东大学2016研]

(1)(Gly)20和(Glu)20;pH=7.0

(2)(Lys-Ala)3和(Phe-Met)3;pH=7.0

(3)(Ala-Ser-Gly)5和(Asn-Ser-His)5;pH=6.0

答:多肽在水中的溶解性主要取决于侧链基团的极性,尤其取决于可电离基团的数目,可电离基团越多,溶解性就越大,而可电离基团的解离又取决于溶液的pH。若两个多肽的净电荷相同,则含极性侧链多者,溶解性大;若两个多肽的净电荷相同,极性集团的数目也想通,那么非极性小的则溶解性稍大。根据上述原则可知:

在pH=7.0,(Gly)20>(Glu)20

在pH=7.0,(Lys-Ala)3>(Phe-Met)3

在pH=6.0,(Ala-Ser-Gly)5 <(Asn-Ser-His)5

六、论述题

1请列举三种蛋白质分子量的测定方法,并简述其原理。[四川大学2001研]

答:(1)测定蛋白质分子量的方法很多,例如渗透、折散速率,沉降分析等,主要的分子量的测定方法有:

沉降法:又称超速离心法,蛋白质溶液经高速离心时由于比重关系,蛋白质分子趋于下沉,沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比,利用m=RTS/D(1-Vρ)即可求出其分子量m。

凝胶过滤法:又称分子排阻层析或分子筛层析法,在层析柱中装入葡聚糖凝胶,这种凝胶颗粒中具有大量微孔,这些微孔只允许较小的分子进入胶粒,而大于胶粒微孔的分子则不能进入而被排阻,当用洗脱液洗脱时,被排阻的分子质量大的蛋白质先被洗脱下来,分子质量小的后下来,根据检测样品的洗脱体积可以求出其分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法:蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳的速度取决于分子质量的大小。根据蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系,可以求出蛋白质分子量。

(2)测定蛋白质相对分子质量的最重要的方法是利用超速离心机的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系数(s)的定义是单位离心场强度的沉降速度。s也常用来近似地描述生物大分子的大小。凝胶过滤是一种简便的测定蛋白质分子量的方法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)用于测定单体蛋白质或亚基的分子量。

2简述3种生物化学中常用的层析技术及原理。[中山大学2018研]

答:生物化学中常用的层析技术和原理如下:

(1)凝胶过滤层析

原理:凝胶过滤层析是指当把蛋白质混合样品加入到凝胶柱中时,由于不同蛋白质的分子大小不同,小分子物质可以进入凝胶网孔内部,而大分子物质则只能在凝胶颗粒分子的缝隙中流动,当用洗脱液洗脱时,大分子物质流程短,速度快,因此先被洗脱出来;而小分子物质流程长,速度慢,因此最后被洗脱出来,这样就可以达到分离的目的。

(2)亲和层析

原理:亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法,它是根据不同蛋白质对特定配体的特异而非共价结合的能力不同进行蛋白质分离的。将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液, 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。

(3)离子交换层析

原理:离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH,所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。不同的蛋白质有不同的等电点,在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同,因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时,亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱,而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此,可通过增加缓冲液的离子强度或改变酸碱度,便可改变蛋白质的吸附状况,使不同亲和力的蛋白质得以分离。

3简述蛋白质一级、二级、三级及四级结构,并说明一级结构与空间结构的关系。[武汉大学研]

答:(1)蛋白质一级、二级、三级及四级结构

蛋白质是生物大分子,具有明显的结构层次性,由低层到高层可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础,它决定蛋白质的高级结构。

二级结构是指肽链主链的空间走向(折叠和盘绕方式),是有规则重复的构象。肽链主链具有重复结构,其中氨基是氢键供体,羰基是氢键受体。通过形成链内或链间氢键可以使肽链卷曲折叠形成各种二级结构单元。复杂的蛋白质分子结构,就由这些比较简单的二级结构单元进一步组合而成。

三级结构是指多肽链中所有原子和基团的构象。它是在二级结构的基础上进一步盘曲折叠形成的,包括所有主链和侧链的结构。

四级结构是指由蛋白质亚基的空间排布和亚基次级键间的相互连接而组成的空间结构。由两条或两条以上肽链通过非共价键构成的蛋白质称为寡聚蛋白。其中每一条多肽链称为亚基,每个亚基都有自己的一、二、三级结构。亚基单独存在时无生物活性,只有相互聚合成特定构象时才具有完整的生物活性。四级结构就是各个亚基在寡聚蛋白的天然构象中空间上的排列方式。

(2)一级结构与空间结构的关系

一级结构是蛋白质的共价键的全部情况,一级结构包含着决定高级结构的因素,蛋白质的种类和生物活性都与肽链的氨基酸种类和排列顺序有关,蛋白质分子肽链的排列顺序包含了自动形成复杂的三维结构(即正确的空间构象)所需要的全部信息,所以一级结构决定其高级结构,蛋白质的空间结构取决于蛋白质的一级结构。

4一位15岁的非洲裔美国小女孩症状为发烧、肌肉疼痛、兼贫血和尿路感染,初步诊断为镰刀状细胞贫血病(Sickle cell disease)。镰刀状细胞贫血病患者的红细胞之所以变形是由于不正常的血红蛋白引起的。

(1)解释血红蛋白的结构和其结合氧气的相关性。

(2)分别从一级和空间结构层次比较镰刀状细胞血红蛋白和正常细胞血红蛋白的不同。

(3)用什么实验方法区别镰刀状细胞血红蛋白和正常细胞的血红蛋白?[华中科技大学2016研]

答:(1)血红蛋白是由四条多肽链组成的,分别是两条α链和两条β链。每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间,可保护血红素分子不与水接触,以及Fe2不被氧化。Fe2位于血红素卟啉环的中央,与卟啉环的4个吡咯基、O2及多肽链上的组氨酸形成六配位体。每个血红蛋白分子有四个亚基,可以与4个氧分子可逆结合。

血红蛋白与氧气的结合过程为:

当O2与血红蛋白的Fe2结合后,盐键逐步断裂,血红蛋白分子逐步由T型变为R型,对O2的亲和力逐步增加,R型的O2亲和力为T型的数百倍。也就是说,Hb的4个亚单位无论在结合O2或释放O2时,彼此间有协同效应,即1个亚单位与O2结合后,由于变构效应的结果,其他亚单位更易与O2结合;反之,当HbO2的1个亚单位释出O2后,其他亚单位更易释放O2,因此血红蛋白与氧结合的氧离曲线呈S形。

(2)从一级结构上来说,镰刀状细胞血红蛋白和正常细胞血红蛋白都有两条α链和两条β链组成,正常人血红细胞β链N端的第六位氨基酸为谷氨酸,而患镰刀状细胞贫血症的人的血红细胞β链N端的第六位氨基酸变为缬氨酸。

从空间结构上来说,谷氨酸为酸性氨基酸,具有亲水性,而缬氨酸为非极性脂肪族氨基酸,具有疏水性,氨基酸发生变化之后,原来亲水的部位变为疏水部位,蛋白质内部的氢键连接和疏水键连接改变,引起了三级结构的变化,所以血红蛋白在进行空间折叠时,血红蛋白由正常的球形变为棒状,以致成为镰刀状细胞血红蛋白。

(3)可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法将区别镰刀状细胞血红蛋白和正常细胞的血红蛋白区别开来,原理是:血红蛋白中的珠蛋白和其他蛋白质一样为两性电解质,在不同的缓冲液中可带正或负电荷,因此在电场中可以向阴极或阳极移动,由于镰刀状细胞血红蛋白和正常细胞的血红蛋白的等电点、分子大小和形状及所带电荷的不同,在电场中的移动速率也不一样,反映出来的是迁移率不一样,因此可以将镰刀状细胞血红蛋白和正常细胞的血红蛋白区别开来。

5列举并阐述五种研究蛋白质和DNA相互作用的方法。[华中科技大学2016研]

答:研究蛋白质和DNA相互作用的方法主要有以下几种:

(1)凝胶阻滞实验

凝胶阻滞实验又称DNA迁移率变动试验或条带阻滞实验,是在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

原理:在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质,那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,于是朝正极移动的距离也就相应的缩短,因而在凝胶中出现滞后的条带。

(2)甲基化干扰实验

原理:是根据DMS(硫酸二甲酯)能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤(G)残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割,然后再进行凝胶电泳,最后作放射自显影,读片并分析结果。

(3)DNA pull down

DNA pull down-MS是体外研究DNA与蛋白互作的有力工具。该技术将生物素标记的DNA片段结合在链霉亲和素磁珠上,再与细胞核蛋白孵育,纯化出与DNA片段互作的蛋白,洗涤洗脱得到的蛋白产物,做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合;做质谱鉴定即可筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息(如具体某个或某些转录因子/组蛋白等)。

原理:DNA pull down实验首先针对靶标区域设计DNA探针,探针经过脱硫生物素标记,跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育,纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体,洗脱得到DNA片段的结合蛋白质。

(4)足迹实验

足迹实验是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。

原理:当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI酶的切割作用,而不会产生出相应的切割分子,结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,称为“足迹”。

(5)DNA竞争实验

原理:在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA,如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质,那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的,这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉,而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态,可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带;如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子,结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。

6研究蛋白质分离纯化时,有关等电点的技术有哪些?[华中科技大学2017研]

答:研究蛋白质分离纯化时,有关等电点的技术有:

(1)等电点沉淀法。利用两性电解质在等电点时溶解度最低,以及不同两性电解质等电点不同的特性,通过调节溶液pH,使蛋白质或杂质沉淀析出,从而使蛋白质与杂质分离。

(2)离子交换层析。常用的有阳离子交换和阴离子交换。蛋白质与离子交换剂的结合能力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引,在某一pH条件下,不同蛋白质氨基酸组成不同,等电点不同,所带的静电荷性质、数量、与离子交换纤维素的吸附能力不同。通过改变洗脱液的pH和离子强度,可把不同的蛋白质依次洗脱下来。

(3)等电聚焦:使电泳的介质中形成一定范围的pH梯度,电泳时待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移,直到聚集于与其等电点相同的区域。该技术特别适用于分子量相近而等电点不同的蛋白质分离和分析。

(4)层析聚焦。将蛋白质等两性电解质的等电点的特性和层析的特性结合在一起,实现分离的技术。

7丙氨酸在等电点时,净电荷为零。净电荷为零时,丙氨酸的结构式如下所示有两种,但是在等电点时丙氨酸的主要存在形式是兼性离子形式。(pKa1=2.34;pKa2=9.69)[山东大学2016研]

说明: 2

(1)为什么丙氨酸在等电点的时候主要以兼性离子的形式存在,而不以不带电荷的形式存在?

(2)丙氨酸在等电点时,有多少分子以不带电荷的结构形式存在?写出推导过程。

答:(1)因为羧基的酸性(pKa1=2.34)比质子化的氨基(pKa2=9.69)酸性强得多,因此羧基将倾向于供出质子是氨基质子化,并且其平衡常数是107,这表明平衡常数非常强烈地偏向右边移动:

(2)因丙氨酸的等电点为pH=6.0,首先需要测定丙氨酸处在等电点时[-COO-]/[-COOH]和[H3N]/[-NH2]的比例。利用Henderson-Hass-elbalch,得到:

所以

所以

两者合并起来考虑,两性离子与完全不带电荷的比例是:

因此,丙氨酸处在等电点时,大约有0.4×10-7分子以不带电荷的形式存在的。

综合上述分析,丙氨酸处在等电点时,氨基酸即使以完全不带电的形式存在,其含量也是非常低的,因此绝大部分丙氨酸在等电点时是以兼性离子形式存在的。

8比较肌红蛋白与血红蛋白结合的动力学过程有哪些不同?为什么会造成这样差别?哪些因素影响血红蛋白与氧的亲和力,分析其原理?[山东大学2016研]

答:(1)肌红蛋白与血红蛋白氧饱和曲线,又称氧结合或解离曲线,肌红蛋白的氧结合曲线呈双曲线,而血红蛋白是S型曲线。因为每个肌红蛋白分子仅有一个与O2的结合位置,因此每一肌红蛋白分子和O2的结合均是独立的,和其他肌红蛋白分子无关;而血红蛋白分子是由四个亚基所组成,每一个亚基均有一个与O2的结合位置,血红蛋白分子对O2的结合是四个亚基的协同作用的结果。

(2)以下因素可以影响血红蛋白与氧的亲和力

二氧化碳分压和pH值

a.二氧化碳分压增高,氧解离曲线右移,血红蛋白结合氧的能力降低(血红蛋白释放氧的能力增高)。

b.血液pH值降低,氧解离曲线右移,血红蛋白结合氧的能力降低(血红蛋白释放氧的能力增高)。

温度

机体温度增高,氧解离曲线右移,血红蛋白结合氧的能力降低(血红蛋白释放氧的能力增高),促进血红蛋白快速释放氧;低温(低温麻醉手术时)不利于氧的解离。

2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)

2,3-DPG含量增加,氧解离曲线右移,血红蛋白同氧气的结合力降低。

其他:Hb自身性质的影响。

9详述蛋白质一级结构测定的基本步骤,原理及相关实验技术。[山东大学2017研]

答:(1)蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的序列,一级结构中主要的连接键是肽键。蛋白质一级结构的测定基本步骤为N端分析、C端分析、肽链的拆分、肽链的分离纯化、肽段的氨基酸序列测定、找“重叠肽”,从而推断整个肽链的氨基酸序列肽链氨基酸全序列的确定和二硫键位置的确定。

(2)蛋白质一级结构测定的原理为:一级结构的测定多半用小片段重叠的原理,即用两种或两种以上不同的方法将蛋白质多肽链水解,各自得到一系列肽段,然后将这些肽段分离纯化,分别测定这些肽段的氨基酸序列,最后比较这些肽段之间的重叠关系,从而推出整个蛋白质分子中氨基酸的序列。

(3)蛋白质一级结构测定的相关实验技术如下表所示。

表1-3-1 蛋白质一级结构测定的相关实验技术