第三节 固体菌种制作
一、母种生产
1.常用的斜面母种培养基配方
1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）配方：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂18～20克，水1000毫升。
2）马铃薯葡萄糖蛋白胨琼脂培养基配方：马铃薯（去皮）200克，蛋白胨10克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。
3）马铃薯综合培养基配方：马铃薯（去皮）200克，磷酸二氢钾3克，维生素B12～4片，葡萄糖20克，硫酸镁1.5克，琼脂20克，水1000毫升。
2.木腐菌种培养基
1）麦芽浸膏10克，酵母浸膏0.5克，硫酸镁0.5克，硝酸钙0.5克，蛋白胨1.5克，麦芽糖5克，磷酸二氢钾0.25克，琼脂20克，水1000毫升。
2）酵母浸膏15克，磷酸二氢钾1克，硫酸钠2克，蔗糖10～40克，麦芽浸膏10克，氯化钾0.5克，硫酸镁0.05克，硫酸铁0.01克，琼脂15～25克，水1000毫升。
3.保藏菌种培养基
1）玉米粉50克，葡萄糖10克，酵母膏10克，琼脂15克，水1000毫升。
2）蛋白胨10克，葡萄糖1克，酵母膏5克，琼脂20克，水1000毫升。
3）硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾1克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾0.5克，蛋白胨2克，琼脂15克，水1000毫升。
4.母种培养基的配制
（1）材料准备 选取无芽、无变色的马铃薯，洗净去皮，称取200克，切成1厘米左右的小块。同时准确称取好其他材料。酵母粉用少量温水溶化。
（2）热浸提 将切好的马铃薯小块放入1000毫升水中，煮沸后用文火保持30分钟。
（3）过滤 煮沸30分钟后用4层纱布过滤（图2-34）。
图2-34 过滤
母种棉塞的制作
（4）琼脂溶化 将琼脂粉事先溶于少量温水中，然后倒入培养基浸出液中溶化。煮琼脂时要多搅拌，直至完全溶化。
（5）定容 琼脂完全溶化后，将各种材料全部加入液体中，加水定容至1000毫升，搅拌均匀。
（6）分装 选用洁净、完整、无损的玻璃试管，进行分装。一般分装量为试管长度的1/5～1/4。
【注意】不要使培养基残留在近试管口的壁上，以免日后污染。若试管壁上沾有培养基，待冷却后用小手指把培养基推至离管口4～5厘米处（图2-35），然后再塞棉塞。
分装完毕后，塞上棉塞（选用干净的梳棉制作），棉塞长度为3～3.5厘米，塞入管内1.5～2厘米，外露部分1.5厘米左右，松紧适度，以手提外露棉塞试管不脱落为度。然后将7支试管捆成1捆，用双层牛皮纸将试管口一端包好扎紧（图2-36）。
图2-35 去除试管口的培养基
（7）灭菌 灭菌前，先向锅内加足水分，然后将包扎好的试管直立放入灭菌锅套桶中，盖上锅盖，对角拧紧螺钉（图2-37），关闭放气阀，开始加热。严格按照灭菌锅使用说明进行操作，在0.15兆帕压力下保持30分钟。
母种制作——灌管
培养基分装（试管）
塞上棉塞
图2-36 扎捆
图2-37 拧紧锅盖
（8）摆斜面 待压力自然降压至0时，打开放气阀放掉余气后，打开锅盖，自然降温20～40分钟后再摆放斜面。斜面长度以斜面顶端距离棉塞40～50毫米为好（图2-38）。
图2-38 摆斜面
【提示】如果不降温就摆放斜面，会由于温差过大，试管内易产生过多的冷凝水（图2-39）。斜面摆放好后，在培养基凝固前，不宜再搬动。为防止斜面凝固过快，在斜面上方的试管壁形成冷凝水，可在摆好的试管上覆盖一层棉被，低温季节尤其重要。
图2-39 斜面上方产生冷凝水
（9）无菌检查 随机抽取3%～5%的试管，置于28℃恒温培养箱中，48小时后检查，无任何微生物长出的为灭菌合格，即可使用。
5.母种接种
（1）接种前准备
1）接种前，必须彻底清理打扫接种室（箱），经喷雾和熏蒸消毒后，使其成为无菌状态。工作人员穿好工作服，戴好口罩、工作帽。
2）清洗干净接种工具，一般为金属材料的针、刀、耙、铲和钩。
3）用肥皂水洗手，擦干后再用70%～75%酒精棉球擦拭双手、菌种试管及一切接种用具。
4）可事先在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期等。
5）将接种所需物品移入超净工作台（接种箱），按工作顺序放好，检查是否齐全，并用5%石炭酸（苯酚）溶液重点在工作台下方附近的地面上喷雾消毒，打开紫外线灯照射灭菌30分钟（图2-40）。
（2）接种
1）关闭紫外灯（若需开日光灯，需间隔20分钟以上才可打开），用75%酒精对双手（图2-41）和母种外壁消毒，并点燃酒精灯，其火焰周围10厘米区域均为无菌区，在该区接种可以避免杂菌污染。
2）将菌种和斜面培养基的2支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分，斜面向上并使它处于水平位置，先将棉塞用右手拧转松动，以利于接种时拔出。
图2-40 紫外灯消毒
图2-41 接种人员双手消毒
【提示】拔棉塞时要旋转拔出，要使缓劲，否则会引起空气剧烈振动，使外界空气进入试管。
3）右手拿接种钩，在火焰上方将工具灼烧灭菌，凡在接种时进入试管的部分，都用火焰灼烧灭菌，操作时要使试管口靠近酒精灯火焰。
4）用右手小拇指、无名指、中指同时拔掉2支试管的棉塞，并用手指夹紧，用火焰灼烧管口（图2-42），灼烧时应不断转动试管口，杀灭试管口可能沾染上的杂菌。
5）将烧过并经冷却后的接种钩伸入菌种管内，去除上部老化、干瘪的菌丝块，然后取0.5厘米×0.5厘米大小的菌块，迅速将接种钩抽出试管，注意不要使接种钩碰到管壁。
6）在火焰旁迅速将接种钩伸进待接种试管，将挑取的菌块放在斜面培养基的中央（图2-43）。注意不要把培养基划破，也不要使菌种沾在管壁上。
7）抽出接种钩，灼烧管口和棉塞，并在火焰旁将棉塞塞上。每接3～5支试管，要将接种钩在火焰上再次灼烧灭菌，以防大面积污染。
图2-42 灼烧管口
图2-43 接种
母种的转接
试管转接（无菌接种）
6.培养
（1）恒温培养 接种完毕，将接好的试管菌种放入22～24℃的恒温培养箱中培养。
（2）污染检查 接种后2天内要检查1次接种后杂菌污染的情况，如果在试管斜面培养基上发现有绿色、黄色、黑色等非白色、非生长整齐一致的斑点、块状杂菌，应立即剔除。以后每2天检查1次。挑选出菌丝生长致密、洁白、健壮，无任何杂菌感染的试管菌种，放于2～4℃的冰箱中保藏。
二、原种、栽培种生产
1.常见培养基及制作
（1）以棉籽壳为主料培养基 见图2-44。
1）棉籽壳培养基配方：
①棉籽壳99%，石膏1%，含水量60%±2%。
图2-44 棉籽壳为主料的培养基
②棉籽壳84%～89%，麦麸10%～15%，石膏1%，含水量60%±2%。
③棉籽壳54%～69%，玉米芯20%～30%，麦麸10%～15%，石膏1%，含水量60%±2%。
④棉籽壳54%～69%，阔叶木屑20%～30%，麦麸10%～15%，石膏1%，含水量60%±2%。
2）棉籽壳培养基制作：先按配方比例计算出所需要的各原料的量，称取原料，再加入适量的水。适宜含水量的简便检验方法是用手抓一把加水拌匀后的培养料紧握，当指缝间有水但不滴下时，料内的含水量为适度。
（2）以木屑为主料培养基
1）木屑培养基配方：
①阔叶树木屑78%，麸皮或米糠20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量58%±2%。
②阔叶树木屑63%，棉籽壳15%，麸皮20%，糖1%，石膏1%，含水量58%±2%。
③阔叶树木屑63%，玉米芯粉15%，麸皮20%，糖1%，石膏1%，含水量58%±2%。
2）木屑培养基制作：同棉籽壳培养基的制作。
（3）以麦粒为主料培养基
1）麦粒培养基配方：小麦93%，杂木屑5%，石灰或石膏粉2%。
2）麦粒培养基制作：小麦过筛，除去杂物，再放入石灰水中浸泡，使其吸足水分，捞出后放入锅中用水煮透。趁热摊开，凉至麦粒表面无水膜，加入石膏、拌匀，然后装瓶、灭菌。
【提示】麦粒培养基制作的要点是“煮透、晾干”，煮透是指掰开小麦粒，内部无白心、用牙咬不粘牙、吸足水分，且熟而不烂，无开花现象（图2-45）；晾干指加入石膏前用手抓一把麦粒，松开手小麦粒不粘手、自动下落。
2-45 麦粒为主料的原种栽培种
（4）木块木条培养基
1）木块木条培养基配方：
①木条培养基：木条85%，木屑培养基15%。常用于塑料袋制栽培种，故通常称为木签菌种（图2-46、图2-47）。
图2-46 木签菌种
图2-47 木签菌种的应用
②楔形和圆柱形木块培养基：木块84%，阔叶树木屑13%，麸皮或米糠2.8%，白糖0.1%，石膏粉0.1%。
③枝条培养基：枝条80%，麸皮或米糠19.9%，石膏粉0.1%。
2）木块木条培养基制作：
①木条培养基制作：先将木条在0.1%多菌灵液中浸0.5小时，捞起稍沥水后即放入木屑培养基中翻拌，使其均匀地粘上一些木屑培养基即可装瓶（袋）。装瓶（袋）时尖头要朝下，最后在上面铺约1.5厘米厚的木屑培养基即可。
②楔形和圆柱形木块培养基制作：先将木块浸泡12小时，将木屑按常规木屑培养料的制作法调配好，然后将木块倒入木屑培养基中拌匀、装瓶（袋），最后再在木块面上盖一薄层木屑培养基按平即可。
③枝条培养基制作：选1～2年生、粗8～12毫米的板栗、麻栎或梧桐等适生树种的枝条，先劈成两半，再剪成约35毫米长、一头尖一头平的小段，投入40～50℃的营养液中浸1小时，捞出沥去多余水分，与麸皮或米糠混匀，再用滤出的营养液调节含水量后加入石膏粉拌匀，即可装瓶、灭菌。其中营养液配方为：蔗糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%，混匀后溶于水即可。
【提示】木块木条培养基也可用废弃的一次性木筷制作。
2.培养基灭菌
（1）高压灭菌 木屑培养基和草料培养基在0.12兆帕条件下灭菌1.5小时或0.14～0.15兆帕下1小时；谷粒培养基、粪草培养基和种木培养基在0.14～0.15兆帕条件下灭菌2.5小时。装容量较大时，灭菌时间要适当延长（图2-48）。
图2-48 高压灭菌
【注意】灭菌完毕后，应自然降压至0，不应强制降压。
（2）常压灭菌 常压灭菌是采用常压灭菌锅进行蒸汽灭菌的方法（图2-49）。锅内的水保持沸腾状态时的蒸汽温度一般可达100～108℃，灭菌时间以袋内温度达到100℃以上开始计时。常压灭菌要在3小时之内使灭菌室温度达到100℃，并在100℃下保持10～12小时，然后停火焖锅8～10小时后出锅。母种培养基、原种培养基、谷粒培养基、粪草培养基和种木培养基，应高压灭菌，不应常压灭菌。常压灭菌操作要点是“攻头、控中、保尾”。“攻头”是指菌袋装锅后3小时内锅内温度达到100℃；“控中”是指灭菌中途不能停火；“保尾”是指灭菌8～10小时后，停火焖5～6小时。
图2-49 常压灭菌
1）迅速装料，及时进灶：如果不能及时装料和进灶灭菌，料中存在的酵母菌、细菌、真菌等竞争性杂菌遇适宜条件迅速增殖，尤其是高温季节，如果装料时间过长，酵母菌、细菌等将基质分解，容易引起培养料的酸败，灭菌不彻底。
2）菌种袋应分层放置：菌袋堆叠过高，不仅难以透气，并且受热后的塑料袋相互挤压会粘连在一起，形成蒸汽无法穿透的“死角”。为了使锅内蒸汽充分流畅，菌种袋常采用顺码式堆放，每放4层，放置1层架隔开或直接放入周转筐中灭菌。
【小窍门】 如果常压灭菌出现成批量灭菌不彻底的问题，可在常压灭菌锅四角用不同颜色的绳子系袋，哪种绳子标记的菌袋污染较多，对应的那个方位应是灭菌“死角”。灭菌死角可少放或不放菌袋。
3）旺火高温3小时，加足水量，旺火升温，高温足时。在常压灭菌过程中，如果锅内很长时间达不到100℃，培养基的温度处于耐高温微生物的适温范围内，这些微生物就会在此时间内迅速增殖，严重的造成培养料酸败。因此，在常压灭菌中，用旺火攻头，使灭菌灶内温度在3小时内达到100℃，是取得彻底灭菌效果的因素之一。
【提示】蒸汽的热量首先被灶顶及四壁吸收，然后逐渐向中、下部传导，被料袋吸收。在一般火势下，要经过4～6小时才能透入料袋中心，使袋中温度接近100℃。所以整个灭菌过程中要始终保持旺火加热，最好在4～6小时内要上大气。其间注意补水，防止烧干锅，但不可加冷水，一次补水不宜过多，应少量多次，一般每小时加水1次，不可停火。
4）停火后操作：灭菌时间达到后，停止加热，利用余热再封闭8～10小时。待料温降至50～60℃时，趁热移入冷却室内冷却；同时，趁热进行下一锅菌袋的灭菌。
冷却室
【注意】采用棉塞封口的要趁热在灭菌锅内烘干棉塞，待棉塞干后趁热出锅，不可强行开锅冷却，以免造成迅速冷却使冷空气进入菌种袋内而污染杂菌。趁热出锅，放置在冷却室或接种室内，冷却至28℃左右接种。
【小窍门】 常压灭菌常会出现第一锅灭菌不彻底的情况，主要原因是装锅时锅体凉，升温慢。针对这种情况，可提前对空锅进行一次灭菌，然后再正常进行菌袋灭菌。
3.接种
（1）接种场所
1）接种车间：一般是在木耳工厂化生产菌包的接种室配备空气净化与消毒机，配合超净工作台进行接种。
2）接种室：一般接种室面积以6米2为宜，长3米、宽2米、高2～3米。室内墙壁及地面要平整、光滑，接种室门通常采用左右移动的推拉门，以减少空气振动。接种室的窗户要采用双层玻璃，窗内设黑色布帘，使得门窗关闭后能与外界空气隔绝，便于消毒。有条件的可安装空气过滤器。
【提示】接种室应设在灭菌室和菌种培养室之间，以便培养基灭菌后可迅速移入接种室，接种后即可移入培养室，避免在长距离搬运过程中造成人力和时间的浪费，并招致污染。
3）塑料袋接种帐：用木条或铁丝做成框并用铁丝固定，再将薄膜焊成蚊帐状，然后罩在框架上，地面用木条压住薄膜，即可代替接种室使用。接种帐的容量大小，可根据生产需要确定。一般每次可接种500～2000瓶（袋）。
4）接种箱：见图2-50。
（2）消毒 把菌种瓶（袋）、灭菌后的培养基及接种工具放入接种场所，然后进行消毒。先用3%的煤酚皂液或5%石炭酸水溶液喷雾消毒或使用气雾消毒剂熏蒸消毒30分钟，使空气中微生物沉降，然后打开紫外线灯照射30分钟后接种。操作者进入接种室时，要穿工作服、鞋套，戴上帽子和口罩，操作前双手要用75%酒精棉球擦洗消毒，动作要轻缓，尽量减少空气流动。
图2-50 接种箱
（3）接种
1）原种接种：
①接种前准备好清洁无菌的接种室、待接种的母种菌种、原种培养基及接种工具等，接种人员穿上工作服，将试管母种接入原种瓶，注意瓶装培养基温度要降到28℃以下才可接种。
②点燃酒精灯，各种接种工具先经火焰灼烧灭菌。
③在酒精灯上方10厘米无菌区轻轻拔下棉塞，立即将试管口倾斜，用酒精灯火焰封锁，防止杂菌侵入管内，用消毒过的接种钩伸入菌种试管，在试管壁上稍停留片刻使之冷却，以免烫死菌种，按无菌操作要求将试管斜面菌种横向切割6～8块。
④在酒精灯上方无菌区内，将待接菌瓶封口打开，用接种钩取分割好的菌块，轻轻放入原种瓶内，立即封好口，一般每支母种可接5～6瓶原种。
2）栽培种接种：
①接种前检查原种棉塞和瓶口的菌膜上是否染有杂菌，如果有污染的应弃之不用。
②打开原种封口，灼烧瓶口和接种工具，剥去原种表面的菌皮和老化菌种。
③如果是双人接种，可一人负责拿菌种瓶，用接种钩接种，另一人负责打开栽培种的瓶口或袋口，然后封好口。
④接种的菌种不可扒得太碎，最好呈蚕豆粒或核桃粒状，以利于发菌。
⑤接种后迅速封好瓶口。1瓶谷粒种接种不应超过50瓶（袋），木屑种、草料种不应超过35瓶（袋）。
⑥接种结束后，及时将台面、地面收拾干净，并用5%石炭酸水溶液喷雾消毒，关闭室门。
4.培养
（1）培养室消毒 接种后的菌瓶（袋）在进入培养室前，要对培养室进行消毒灭菌。
（2）菌种培养 原种和栽培种在培养初期，要将温度控制在25～28℃。在培养中后期，将温度调低2～3℃。因为菌丝生长旺盛时，新陈代谢放出热量，瓶（袋）内温度要比室温高出2～3℃，如果温度过高会导致菌丝生长纤弱、老化。在菌种培养25～30天后，要采取降温措施，减缓菌丝的生长速度，从而使菌丝整齐、健壮。一般30～40天菌丝可吃透培养料，然后把温度稍微降低一些，缓冲培养7～10天，使菌种进一步成熟。
（3）污染检查 接种后7～10天，每隔2～3天逐瓶检查1次，发现杂菌立即挑出，拿出培养室，妥善处理，以防引起大面积污染。
【提示】如果在培养料深部出现杂菌菌落，说明灭菌不彻底；而在培养料表面出现杂菌，说明在接种过程中的某一环节没有达到无菌操作要求。无菌四原则如下：
1）不产生杂菌：清理残料、木质、纸类等杂菌可能繁殖的物料。
2）不聚集杂菌：无菌室表面及墙角要做得平滑、易清扫。
3）不带入杂菌：穿戴专用的着装，工具严格消毒后带入、密封。
4）清除杂菌：采用高效过滤器、杀菌剂、臭氧等消毒。