第五章 工业菌种的分离和纯培养技术
【知识目标】
（1）了解微生物纯培养及接种技术的相关概念和重要意义，并会无菌室的建立及净化工作台等无菌操作仪器设备的使用。
（2）掌握纯培养的常见分离方法和工业微生物菌种纯种培养的相关方法，熟悉无菌操作的注意事项和相关要求。
【能力目标】
能按照企业菌种岗位、发酵岗位对能力要求在无菌操作下完成工业微生物接种，能熟练进行工业微生物的纯种培养操作，能分析和解决生产过程中实际遇到的困难和问题。
第一节 工业微生物菌种的分离
分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。
一、无菌技术
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术，它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1.微生物培养的常用器具及其灭菌
试管、玻璃烧瓶、平皿等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养基可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物污染而设计的。
2.接种操作
用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。
用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而转移液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。
二、用固体培养基分离纯培养物
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.平板划线分离法
平板法采用Petri培养皿（简称培养皿），它是副互扣的玻璃平面盘。互扣的培养皿经过灭菌，内部保持无菌。将经过灭菌的培养基注入无菌的培养皿中，培养基内含有凝固剂（最常用的琼脂），可制成固体培养基平板。
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，见图5-1，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而逐渐减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落，获得纯培养物。
图5-1 平板划线分离法示意图
2.稀释法
稀释法是一种将样品梯度稀释，直至能在平板培养基上形成单菌落，再挑取单菌落进行培养以获得纯培养物的方法。
（1）稀释倒平板法 先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000等，见图5-2），然后分别取不同浓度的稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倒入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一段时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板培养基表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能不是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，进行培养，即可得到纯培养物。
图5-2 样品的稀释和稀释液的取样培养
（2）稀释混合平板法 稀释混合平板法是将待分离的样品进行一系列的梯度稀释（如1:10、1:100、1:1000等），后用无菌吸管吸取经过稀释的菌悬液1mL注入培养皿，再倒入已熔化并冷却到45℃左右的培养基中，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后在一定的温度下培养，若出现单菌落，则可挑取单个菌落重复以上操作或划线，即可得到纯培养，见图5-3。
图5-3 涂布法和倾注平板法操作示意图
（3）稀释涂布平板法 此法与稀释混合平板法大致相同，见图5-3。所不同的是，此法先将高温的液态固体培养基摇匀，在火焰旁注入培养皿，静置冷却后制成平板，然后用无菌吸管吸取不同稀释度的菌悬液0.1mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布器在培养基表面轻轻涂布均匀，置于适宜条件下，倒置培养一段时间，出现分散菌落后，再挑取单个菌落，划线直至获得纯培养。
以上稀释方法均适用于好氧微生物的纯培养分离，而厌氧微生物的纯培养获得则需使用其他的方法，如稀释摇管法。
3.稀释摇管法
用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一个灭菌针将液体石蜡-石蜡盖取出，再将一支毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。
三、用液体培养基分离纯培养物
对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。
通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的概率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95％）表现为不生长。
四、单孢子或单细胞分离法
采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法，称为单细胞（单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体较小的细菌则较难。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中应用。
五、利用选择性培养基分离法
各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等的抵抗能力不同，利用这些特性可配制适于某种微生物而限制其他微生物生长的选择培养基，用来培养微生物，以获得纯培养。这种方法非常适合含量低的微生物，如某一微生物在每克土壤中的含量仅为102～103，则用平板稀释法就难以分离。通常采用选择培养基使之数量增加后，再用平板稀释法分离。常用以下两种方式。
1.利用选择培养基直接分离
分离任何一种特定的微生物，其所使用的培养基，在某种程度上都是有选择性的。如果在培养基中接种多种微生物，也只有那些能够生长的才能增殖，其他的都要受到抑制。在分离某种微生物时，如果事先能对它的营养需求有所了解，就可以设计出对这个微生物比其他微生物更为优越的培养条件，以促进其生长。使用特定的选择性培养基，可以从自然界分离出预期的有用微生物。为此，首先要设计一个通过物理或化学手段使目的微生物能很好生长，而其他微生物不易生长的条件筛选分离，即根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。如在土壤中筛选蛋白酶产生菌，可在培养基中加牛乳或酪素，微生物生长时若产生蛋白酶，则会水解牛乳或酪素，产生蛋白质水解圈，这样可将大量非产蛋白酶的微生物淘汰。也可用高温、抗生素等分离一些特定的微生物。
应用这种选择性培养基可以有效地达到分离的预期目的，这样分离出来的微生物还要进行多次单菌落分离，以达到完全纯化的目的。工业上，为了筛选有用微生物，往往制备多种不同的选择性培养基。
值得注意的是，当一个混合菌群（包括不同种类的各种微生物）分布在有选择性的固体培养基表面时，各种能生长的微生物开始产生各自的群体。在培养基上分散开来的微生物，很大程度上消除了它们之间对营养物质的竞争。这样导致生长慢的微生物同样能在同一环境下存在。为了减少后期单菌落分离的次数，可以对待分离材料进行预先处理。例如，分离芽孢杆菌时，可将样品预先在80℃加热5～15min，即可达到目的。
2.富集培养
其原理是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制订特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物生长旺盛，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易分离出特定的微生物。富集培养的条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及综合因素等多个方面进行选择，如温度、pH值、紫外线、压力、光照、氧气、营养等许多方面。如在土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物，可以使用此方法。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，接种少量土样，经适宜培养后，取少量培养物转接到另一新鲜培养基中，在同样条件下培养，如此重复多次，使该种微生物得到富集，再在平板上涂布，获得单菌落，挑取单菌落分别培养在没有该底物的培养基中和有该底物的培养基上，在有底物的培养基上能生长，则为该种微生物。
在实际操作时，富集培养往往需要设计一个基础培养基，以适应绝大多数微生物的需要，然后根据需分离的目的微生物的特定要求，配入其所需的碳、氮源，必要时还可加入少量维生素、生物素等。以细菌的富集培养为例，基础培养基见表5-1，富集培养条件见表5-2。
表5-1 细菌富集培养基础培养基
表5-2 细菌富集培养的条件
在工业微生物的纯培养处理中，由于待分离微生物与混杂微生物在数量、营养要求、生理状态等方面的关系较为复杂，因此经常需要几种方法相互配合才能取得理想的分离结果。
几种纯培养分离方法的应用范围见表5-3。
表5-3 微生物纯培养分离方法的比较
六、二元培养物
分离的目的通常是要得到纯培养，然而，在有些情况下这是做不到的或是很难做到。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有两种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有两种微生物，而且是有意识地保持两者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。
在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物组成，例如，纤毛虫、变形虫和黏菌。对于这些生物，两者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。
第二节 工业菌种纯培养方法
一个良好的微生物培养装置的基本条件是：按目标微生物的生长规律和营养要求进行科学的设计，能在提供丰富而充足的营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件（只有厌氧菌例外）。此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件，且严防杂菌污染等。
从历史发展的角度来看，微生物培养技术发展的轨迹有以下特点：①从小量培养到大规模培养；②从浅层培养发展到厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养；③从以固体培养为主到以液体培养为主；④从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养；⑤从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；⑥从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化细胞；⑦从单纯利用微生物细胞到利用动物、植物细胞进行大规模培养；⑧从利用野生型菌种发展到利用变异株直至遗传工程菌株；⑨从单菌发酵发展到混菌发酵；⑩从低密度培养发展到高密度培养；
从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等。
在培养工业微生物的过程中，除大规模的反应器培养外，在孢子及种子制备阶段也常常需要进行实验室培养。以下就实验室和生产实践中一些较有代表性的微生物培养法作一简要介绍。
一、实验室培养法
1.固体培养法
（1）好氧菌的固体培养 将微生物接种在固体培养基表面进行生长繁殖的方法，称固体培养法。广泛用于好氧微生物菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。主要包括：
a.试管斜面，用于微生物形态观察或菌种保藏；b.培养皿琼脂平板，用于微生物形态观察、分离和活菌计数、菌种保藏，如图5-4所示。
图5-4 小量固体培养示意图
为了获得较多菌体提高培养效率，常采用增大培养表面积的办法，实验室多采用较大型的克氏扁瓶、茄形瓶斜面等，如图5-5。工厂也有采用曲盘、帘子以及通风制曲池等方法培养菌体的。
图5-5 大量固体培养示意图
（2）厌氧菌的固体培养 实验室中培养厌氧菌除了需要特殊的培养装置或器皿外，首先应配制特殊的培养基。在厌氧菌培养基中，除保证提供6种营养要素外，还得加入适当的还原剂，必要时，还要加入刃天青等氧化还原指示剂。具体培养方法如下。
①高层琼脂柱 把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，经灭菌后，除表层尚有一些溶解氧外，越是深层，其氧化还原电势越低，故有利于厌氧菌的生长。例如，韦荣管就是由一根长25cm、内径1cm，两端可用橡胶塞封闭的玻璃管，可作稀释分离厌氧菌，并对其进行菌落计数。
②厌氧培养皿 用于培养厌氧菌的培养皿有几种：有的是利用特制皿盖去创造一个狭窄空间，再加上还原性培养基的配合使用而达到厌氧培养的目的，如Brewer皿（图5-6）；
图5-6 几种厌氧培养皿
有的利用特制皿底——有两个相互隔开的空间，其一是放焦性没食子酸，另一则放NaOH溶液，待在皿盖的平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭，经轻摇动，上述两试剂因接触而发生吸氧反应，于是造成无氧环境，例如图5-6中的Spray皿或Bray皿。
③亨盖特滚管技术 此法由著名美国微生物学家R.E.Hungate于1950年设计而得名。这一技术是厌氧菌微生物学发展历史上的一项划时代的创造，由此推动了严格厌氧菌（如瘤胃微生物区系和产甲烷菌）的分离和研究。其原理是：利用除氧铜柱（玻璃柱内装有大量密集铜丝，加温至350℃时，可使通过柱体的不纯氮中的O2和铜反应而被除去）来制备高纯氮，再用高纯氮驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、稀释、培养、观察、分离、移种和保藏等操作的全过程始终处于严格无氧条件下，从而保证了各类严格厌氧菌的存活。用严格厌氧方法配制、分装、灭菌的厌氧菌培养基称做预还原无氧灭菌培养基，即“PRAS培养基”（pre-re-duced anaerobically sterilized medium）。在进行产甲烷菌等严格厌氧菌分离时，可先用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释，并用注射器接种到装有融化的PRAS琼脂培养基试管中，见图5-7。该试管用密封性极好的丁基橡胶塞严密塞紧后平放，置于冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管内表面上（犹如将好氧菌浇注或涂布在培养皿平板上），培养后，即可长出许多单菌落。Hungate滚管技术的优点是：试管内壁上的琼脂层有较大的表面积可供厌氧菌长出单菌落，且试管口的面积和试管腔体积都极小，特别有利于阻止氧与厌氧菌接触。
图5-7 用于Hungate滚管技术中的厌氧试管（剖面）
④厌氧罐技术 这是一种经常使用，但不是很严格的厌氧菌培养技术，原因是它仅能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧环境，但无法使培养基配制、接种、观察、分离、保藏等操作也不接触氧气。其装置如图5-8所示，厌氧罐的类型和大小不一，通常都有一个用聚碳酸酯制成的圆柱形透明罐体（内可放10个常规培养皿），其上有一个可用螺旋夹紧紧夹牢的罐盖，盖内的中央有一个用不锈钢丝织成的催化剂室，内放置钯催化剂，罐内还放有一种含有美蓝溶液的氧化还原指示剂。使用时，先装入接种后的培养皿或试管菌样，然后封闭罐盖，接着采用抽气换气法彻底驱除罐内原有空气，一般操作步骤为：
抽真空→灌N2→抽真空→灌N2→抽真空→灌混合气体（N2:CO2:H2体积比为80:10:10）之后，罐内仅存的少量氧气又被钯催化剂催化，与灌入混合气体中的H2生成H2O，从而形成良好的无氧状态（美蓝指示剂从蓝色变为无色）。
图5-8 厌氧罐的一般构造
国际上早已盛行用方便快捷的“GasPak”内源性产气袋商品来取代上述烦琐的抽气换气过程。只要把这种产气袋剪去一角并注入适量水后投入厌氧罐，并立即封闭罐盖，它就会自动缓缓放出足够的CO2和H2。
⑤厌氧手套箱技术 这是20世纪50年代末问世的一种用于培养、研究严格厌氧菌用的箱形装置和相关的技术措施。手套箱箱体结构严密、不透气，其内充满N2:CO2:H2=85:5:10（体积比）的惰性气体，并有钯催化剂维持箱内处于严格无氧状态。通过塑料手套可对箱内进行各种操作，此外箱内还设有恒温培养箱，以随时进行厌氧菌的培养。外界物品进出箱体可通过有密闭和抽气换气装置的交换室（由计算机自控）进行。厌氧手套箱的外观见图5-9所示。
图5-9 厌氧手套箱外观图
上述的厌氧罐技术、厌氧手套箱技术和亨盖特滚管技术已成为现代实验室中研究厌氧菌最有效的3种技术，有各自的特点，其原理、构造、操作要点和优缺点的比较见表5-4。
表5-4 3种现代常用厌氧培养技术的比较
2.液体培养法
（1）好氧菌的液体培养 由于大多数微生物都是好氧菌，而且微生物一般只能利用溶于水中的氧，故如何保证在培养液中始终有较高的溶解氧浓度就成为重要的生长条件之一。在一般情况下（1atm，20℃），氧在水中的溶解度仅为6.2mL/L（0.28mmoL），这些氧气仅能保证氧化8.3mg（0.046mmoL）的葡萄糖，这一数值仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的千分之一。除葡萄糖外，培养基中的其他有机或无机营养物质一般都可保证微生物使用几小时至几天。因此，氧的供应始终是好氧菌生长繁殖过程的限制因子。解决这一矛盾，就必须设法增加培养液与氧的接触面积或提高氧分压，以提高溶氧速率，具体措施有：①浅层液体静止培养；②将锥形瓶内培养物放置于摇床上做摇瓶培养；③在深层培养液底部通入加压空气，并用气体分布器使其形成均匀、密集的小气泡；④对培养液进行机械搅拌，且在培养器的壁上设置阻挡装置等。
实验室中常用的好氧菌培养法有以下几类。
①试管液体培养 装液量可多可少。此法通气效果不够理想，仅适合培养兼性厌氧菌。
②锥形瓶浅层液体培养 在静止状态下，其通气量与装液量和通气塞的状态有密切的关系，见表5-5。此法一般仅适用于兼性厌氧菌的培养。
表5-5 培养液的装量对粪壳菌的生长速度和生长量的影响
③摇瓶培养 摇瓶培养又称振动培养。将装有培养液的锥形瓶的瓶口用8层纱包扎，以利于通气和防止杂菌污染，同时减少瓶内装液量，把它放在往复式或旋转式摇床上振荡，以达到提高溶氧浓度的目的。此法最早由著名荷兰学者KluyverA.J.于1933年发明，目前仍广泛用于菌种筛选以及生理生化，发酵和生命科学诸多领域的研究工作中。
④台式发酵罐 这是一种利用现代高科技制成的实验室研究用微生物发酵罐，体积通常为数升至数十升，有良好的通气，搅拌及其他各种必要装置，并配有多种传感器，自动记录和计算机调控装置。现成的商品种类很多，应用较为广泛。
（2）厌氧菌的液体培养 在实验室中对厌氧菌进行液体培养时，若进入上述厌氧罐或厌氧手套箱等设备中，就不必提供额外的培养条件，若是置于有氧环境下培养，则在培养基中必须加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉（牛肉小颗粒）等有机还原剂，或加入铁丝等可以明显降低氧化还原电位的无机还原剂。在此基础上，再采用深层培养或同时在液面上加一层石蜡油或凡士林-石蜡油混合物，则可保证培养基的氧化还原电位（Eb）降至-150～420mV，可适合严格厌氧菌的生长。
二、生产实践中微生物的培养方法
1.固态培养法（主要适合霉菌和酵母培养）
（1）好氧菌的曲法培养 在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都将接种后的固体基质薄薄地铺在容器的表面，这样既可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放，对真菌来说，还十分有利于产生大量孢子，这就是传统的曲法培养的原理。
原始的曲法培养基本培养原料是麸皮、碎麦或豆饼等固态基质，将麸皮和水混合，必要时添加一些辅助营养物和缓冲剂，灭菌，待冷却到适宜温度便可接种，疏松的麸皮培养基便于空气进入，为好氧微生物提供必需的氧气，含水量控制在40％～80％。由于细菌和酵母菌不能在该含水量环境下生长，故被其污染的可能性降低，这也是生产实践中固体培养主要用于霉菌进行食品酿造及其酶制剂生产的原因。
曲的定义可通过图5-10来理解。
图5-10 曲的定义
根据制曲容器的形状和生产规模，可把各种制曲方法分成瓶曲、袋曲（一般用塑料袋制曲）、盘曲（用木盘制曲）、帘子曲（用竹帘子制曲）、转鼓曲（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）和通风曲（即厚层制曲）等。其中瓶曲、袋曲形式在目前的食用菌制种和培养中仍有广泛应用。通风曲是一种机械化程度和生产效率都比较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业中被广泛应用。一般是由一个面积10m2左右的水泥曲槽组成，槽上有曲架和用适当材料编织成的筛板，其上可摊一层约30cm厚的曲料，曲架下部不断通以低温、湿润的新鲜过滤空气，以此制备半无菌状态的固体曲，如图5-11所示。
图5-11 通风曲槽结构模式图
1—天窗；2—曲室；3—风道；4—曲槽；5—曲料；6—篦架；7—鼓风机；8—电动机
（2）厌氧菌的堆积培养法 生产实践上对厌氧菌进行大规模固态培养的例子较为少见，在我国传统白酒生产中，一向采用大型深层地窖对固态发酵物料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等较为有利，因此可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。
总之，固体培养的设备简单，生产成本低，但是pH值、溶解氧和温度等不易控制，耗费劳动力较多，占地面积大，容易污染，生产规模难以扩大。
2.液体培养法
液体培养生产效率高，适于机械化和自动化，所以它是当前微生物发酵工业的主要生产方式，液体培养有静置培养和通气培养两种类型：静置培养通常适于厌氧菌发酵，如酒精、丙酮-丁醇、乳酸等发酵；通气培养适于好氧菌发酵，如抗生素、氨基酸、核苷酸等产品发酵。
（1）好氧菌的培养
①浅盘培养 这是一种用大型盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法。由于没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行氧气交换，是最原始的液体培养形式，在早期的青霉素和柠檬酸等发酵中，均使用过这种方法，但因存在劳动强度大、生产效率低以及易污染杂菌等缺点，故未能广泛使用。
②深层液体通气培养 这是一类应用大型发酵罐进行深层液体通气搅拌的培养技术，是在青霉素等抗生素发酵中发展起来的技术，其生产效率高，易于控制，产品质量稳定，但其动力较大，设备复杂，需要大量投资。它的发明在微生物培养技术发展史上具有革命性的意义，并成为现代发酵工业的标志。
发酵罐是一种最常见的生物反应器，结构如图5-12所示。通常是一钢质圆筒形直立容器，其底和盖为扁球形，高与直径之比一般为1:（2～2.5）。容积可大可小，大型发酵罐一般为50～500m3，目前世界上最大的为英国用于甲醇蛋白生产的巨型发酵罐，其有效容积达1500m3。
图5-12 典型发酵罐的构造及其运转原理
发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富、充足的养料，良好的通气搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能消除泡沫和确保防止污染杂菌等。除了罐体相应的各种结构外，还要有一套附属装置。例如培养基配制系统，蒸汽灭菌系统，空气无菌过滤系统，传感器和自动控制系统，以及发酵产物的后处理系统（俗称“下游加工工程”）等。除了上述典型发酵罐可作为好氧菌的深层液体培养装置外，还有各种多种形式的发酵罐、连续发酵罐和用于固定化细胞发酵的各种生物反应器。
（2）厌氧菌的培养 迄今为止，能做大规模液体培养的厌氧菌仅局限于丙酮丁醇梭菌的丙酮-丁醇发酵一种，由于该菌严格厌氧，故不但可省去通气、搅拌装置，简化工艺过程，还能大大节约能源消耗。由于厌氧发酵罐无通气搅拌装置，所以其体积明显大于好氧发酵罐，可达到2000m3，从而提高了生产效率，也有利于进行连续发酵。
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无菌操作技术的要求
一、无菌室的准备
在微生物实验中，一般小规模的接种操作使用无菌接种箱或超净工作台；工作量大时使用无菌室接种，要求严格的在无菌室内，再结合使用超净工作台。
1.无菌室的设计
无菌室的设计可因地制宜，但应具备下列基本条件。
①无菌室要求严密、避光，隔板以用玻璃为佳。但为了在使用后排湿通风，应在顶部设立百叶排气窗。窗口加密封盖板，可以启闭，也可在窗口用数层纱布和棉花蒙罩。无菌室侧面底部应设进气孔，最好能通入过滤的无菌空气。
②无菌室一般应有里外两间。较小的外间为缓冲间，以提高隔离效果。
③无菌室应安装拉门，以减少空气流动。必要时，在向外一侧的玻璃隔板上安装一个双层的小型玻璃橱窗，便于内外传递物品，减少进出无菌室的次数。
④室内应有照明、电热和动力用的电源。
⑤工作台台面应抗热、抗腐蚀，便于清洗消毒。可采用橡胶板或塑料板铺数台面，见图5-13。
图5-13 无菌室的立视图
2.无菌室内的设备
①无菌室的里外两间均应安装日光灯和紫外线杀菌灯，紫外灯常用规格为30W，吊装在经常工作位置的上方，距地高度2.0～2.2m。
②缓冲间内应安排工作台供放置工作服、鞋、帽、口罩、消毒用药物、手持式喷雾器等，并备有废物桶等。
③无菌室内应备有接种用的常用器具，如酒精灯、接种环、接种针、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球瓶、记号笔等。
3.无菌室的灭菌
（1）熏蒸 在无菌室全面彻底灭菌时使用。先将室内打扫干净，打开进气孔和排气窗通风干燥后，重新关闭，进行熏蒸灭菌。常用的灭菌药剂为福尔马林（含37％～40％甲醛的水溶液）。按6～10mL/m3的标准用量，取出后，盛于铁制容器中，利用电炉或酒精灯直接加热（应能随时在室外中止热源）或加半量高锰酸钾，通过氧化作用加热，使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上。由于甲醛气体具有较强的刺激作用，所以在使用无菌室前1～2h在一搪瓷盘内加入与所用甲醛溶液等量的氨水，放入无菌室，使其挥发中和甲醛，以减轻刺激作用。除甲醛外，也可用乳酸、硫黄等进行熏蒸灭菌。
（2）紫外灯照射 在每次工作前后均应打开紫外灯，分别照射30min，进行灭菌。在无菌室内工作时，切记要关闭紫外灯。
（3）石炭酸溶液喷雾 每次临操作前，用手持喷雾器喷5％石炭酸溶液，主要喷于台面和地面，兼有灭菌和防止微尘飞扬的作用。
4.无菌室空气污染情况的检验
为了检验无菌室灭菌的效果以及在操作过程中空气的污染程度，需要定期在无菌室内进行空气中杂菌的检验。一般可在两个时间进行：一是在灭菌后使用前；二是在操作完毕后。
取牛肉膏蛋白胨琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的平板各3个，于无菌室使用前（或在使用后），在无菌室内揭开，放置台面上，半小时后重新盖好；另有一份不打开的做对照。一并放30℃下培养，48h后检验有无杂菌生长以及杂菌数量的多少，根据检验结果确定应采取的措施。
无菌室灭菌后使用前检验时，应无杂菌。如果长出的杂菌多为霉菌时，表明室内湿度过大，应先通风干燥，再重新进行灭菌；如杂菌以细菌为主时，可采用乳酸熏蒸，效果较好。
5.无菌室操作规则
①将所用的实验器材和用品一次性全部放入无菌室（如同时放入培养基则需用牛皮纸遮盖）。应尽量避免在操作过程中进出无菌室或传递物品。操作前先打开紫外灯照射半小时，关闭紫外灯后，再开始工作。
②进入缓冲间后，应该换好工作服、鞋、帽，戴上口罩，将手用消毒液清洁后，再进入工作间。
③操作时，严格按无菌操作法进行操作，废物应丢入废物桶内。
④工作后应将台面收拾干净，取出培养物品及废物桶，用5％石炭酸喷雾，再打开紫外灯照半小时。
二、接种工具的准备
最常用的接种或移植工具为接种环。接种环是将一段铂金丝安装在防锈的金属杆上制成。市售商品多以镍铬丝（或细电炉丝）作为铂丝的代用品。也可以用粗塑胶铜芯电线加镍铬丝自制，简便适用。
接种环供挑取菌苔或液体培养物接种用。环前端要求圆而闭合，否则液体不会在环内形成菌膜。根据不同用途，接种环的顶端可以改换为其他形式，如接种针等，常用接种工具见图5-14和图5-15。
图5-14 常用接种工具
1—接种针；2—接种环；3—接种钩；4—接种锄；5—接种铲；6—接种匙；7，8—接种刀9—剪刀；10—钢钩；11—镊子；12—弹簧接种枪；13—接种、枪（日本式）
图5-15 接种和分离工具
1—接种针；2—接种环；3—接种钩；4，5—玻璃涂棒；6—接种圈；7—接种锄；8—小解剖刀
玻璃刮铲（涂布器）是稀释平板涂抹法进行菌种分离或微生物计数时常用的工具。将定量（一般为0.1mL）菌悬液置于平板表面涂布均匀，该操作过程需要用玻璃刮铲完成。用一段长约30cm、直径5～6mm的玻璃棒，在喷灯火焰上把一端弯成“了”形或倒“△”形，并使柄与“△”端的平面呈30°左右，见图5-15。玻璃刮铲接触平板的一侧，要求平直光滑，使之既能进行均匀涂布，又不会刮伤平板的琼脂表面。
移液管（吸管）的准备：无菌操作接种用的移液管常为1mL或10mL的刻度吸管。吸管在使用前应进行包裹灭菌，移液管的包裹如图5-16所示。
图5-16 移液管包裹法
三、稀释摇管法
稀释摇管法是用固体培养基来培养严格厌氧的微生物的一种纯培养方法。如果微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后放在封闭的容器中，采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气敏感的微生物，纯培养分离可采用稀释摇管法，它是稀释平板法的一种变通形式。
熔化固体培养基并冷却到50℃左右，将待分离的材料用此培养基梯度稀释（同稀释平板法），迅速摇匀，凝固后在试管中倒入一层固体石蜡和液体石蜡的混合无菌液，在适宜条件下培养，在琼脂柱中形成菌落后，用无菌无氧的空气将琼脂柱吸出，用无菌刀将琼脂柱切成段，进行观察或移植。
［课堂互动］
稀释分离时为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～50℃才能倾入到装有菌液的培养皿内呢？
互动 因为琼脂凝固点一般是40～45℃，过高的温度会杀死微生物，而过低的温度（<40℃）培养基凝固。
［案例分析］
1.有四种细菌，分别属于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳酸杆菌及梭状芽孢杆菌。由于保存菌种时标签失落，需要重新鉴别，你怎样鉴别这四种微生物？
分析 首先做革兰染色能分出：金黄色葡萄球菌（球状、革兰阳性）、大肠杆菌（杆状、革兰阴性）、乳酸杆菌（杆状、革兰阳性）、梭状芽孢杆菌（杆状、革兰阳性、有芽孢）；其次再进行生化实验作进一步的鉴别。
2.为什么缺水比饥饿更易导致生物死亡？
分析 （1）水直接参与一些反应，如蓝细菌利用水作为CO2的还原剂；（2）作为机体内一系列生理生化反应的介质，代谢物只有先溶于水才能反应；（3）营养物质的吸收、代谢产物的排泄都需通过水，特别是微生物没有特殊的摄食器官和排泄器官，这些物质只有溶于水才能通过细胞表面；（4）由于水的比热高，又是良好的热导体，能有效吸收代谢释放的热量，并将热量迅速散发出去，从而有效控制细胞的温度。
［思考题］
1.为什么每次都要将接种环上的多余菌体烧掉？划线时为何不能重叠？
2.在恒温箱中培养微生物为什么要将培养皿倒置？
3.在分离某类微生物时培养皿中出现其他微生物，请说明原因？应如何进一步分离纯化？经一次分离后的菌种是否都是纯种？
4.工业微生物学中常用的液体培养形式主要有哪些？为什么液体培养是当前发酵工业首选的发酵形式？
5.什么是发酵罐？试用简图表示其主要构造和运转特点。
6.在工业微生物中，为什么一直要保持无菌操作？无菌操作的要点包括哪些？如何控制环境无菌？
7.工业微生物常用的接种方法有哪些？适用于哪些情况？
8.在工业微生物接种工作中，需要做哪些准备工作？有什么注意事项？这些工作的现实意义是什么？
9.工业微生物好氧培养与厌氧培养有什么区别？如何实现严格厌氧环境？